大黄牡丹汤药动学及对IBP大鼠的代谢组学研究

发布时间：2020-05-09 18:43

【摘要】：大黄牡丹汤(Dahuang-mudan decoction,DMD)出自古代医学家张仲景的著作《金匮要略》,该方是由大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁和芒硝经过煎煮熬制而成。大黄牡丹汤具有泻热祛湿和破淤消痈的功效,自东汉时期起常用于治疗湿热血瘀肠痈证。现代临床多用于治疗炎症性肠病、急性阑尾炎和急性胰腺炎等炎症性疾病。其中,炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种可侵犯全消化道并伴有免疫异常的全身性疾病,其发病特点表现为反复发作,难以治愈。近年来,IBD发病率在全球呈上升趋势,随着我国IBD发病率逐渐上升,使得揭示IBD发病机制及药物治疗机制愈发重要。然而,目前还没有研究可以系统阐释复方大黄牡丹汤治疗IBD的作用机制。另外,大黄牡丹汤中化学成分众多,但并非所有的成分都是有效成分,因此,在化学物质基础不够明确的情况下,大黄牡丹汤的作用机制研究会受到限制且难以取得实际性的进展。目前,中药复方药效物质基础研究建立了一些有效的方法诸如有效部位研究、拆方研究、指纹图谱研究、血清药物化学研究、中药药动学研究和代谢组学研究等。本文的目的是在揭示大黄牡丹汤化学物质基础的前提下,对其治疗IBD的作用机制进行研究,主要从药动学和代谢组学两方面着手,探讨大黄牡丹汤的药效物质基础及治疗IBD的作用。1.首先,采用超高效液相串联四极杆飞行时间质谱技术(UPLC-Q/TOF-MS/MS)对大黄牡丹汤的主要化学成分进行定性分析,借助高分辨质谱仪所提供的化合物的精确相对分子质量,结合标准品对照,色谱保留时间和一、二级质谱等信息,从大黄牡丹汤水煮剂中鉴定和推断出63个化合物,初步揭示大黄牡丹汤中的主要化学成分。然后,本课题对大鼠口服大黄牡丹汤后吸收入血的成分进行鉴定,在含药血浆中鉴定出大黄牡丹汤的27个化合物。2.在此基础上,本课题选取了 5个在复方及含药血浆中浓度相对较高的代表性活性成分,研究这些化合物的药代动力学行为。实验建立了大鼠血浆中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、芍药苷和苦杏仁苷的定量分析方法并应用于大鼠灌胃口服大黄牡丹汤后的药代动力学研究。结果表明,所测定的5个化合物在测定浓度区间内线性关系良好(r0.997)。方法学考察结果表明所建立的定量方法具有足够的特异性、精密度、准确度和灵敏度。提取回收率和基质效应分别为84.79%-100.38%和86.3%-112.2%之间,批间精密度均小于12.09%,批内精密度均小于6.61%,结果说明建立的方法简便可行、准确可靠且重现性较好,能够应用于5个化合物在大鼠体内的药代动力学研究。3.采用TNBS(trinitrobenzene sulfonic acid,三硝基苯磺酸)/乙醇诱导建立IBD大鼠模型及大黄牡丹汤干预治疗效果的研究中,将32只雄性SD大鼠随机分为正常组(Control group)、IBD 模型组(Model group)、大黄牡丹汤组(DMD group)和美沙拉嗪组(Mesalazine group),每组8只。通过一般行为学观察、炎症细胞因子检测、血常规和结肠组织病理学变化等指标来评价大黄牡丹汤对TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠的治疗效果。结果表明,IBD大鼠与正常组相比,炎症状态明显。其中,白细胞数(while blood cell,WBC)、淋巴细胞数(lymphacyte,Lymph)、红细胞数(red blood cell,RBC)及中性粒细胞数(granulocyte,Gran)显著升高(P0.05),血清中的炎症细胞因子白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量显著高于正常组(P0.05),而且模型组大鼠结肠组织病变明显,符合IBD模型大鼠诊断标准。经大黄牡丹汤治疗后,以上指标均得到不同程度回调,接近正常组大鼠,表明大黄牡丹汤具有缓解TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠炎症症状、调节免疫反应和修复肠道组织损伤的作用。4.最后,基于超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS/MS),我们采用代谢组学研究方法从血清及尿液内源性代谢小分子层面探究大黄牡丹汤治疗TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠作用机制。基于单变量及多变量的数据统计法,采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析方法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析方法(OPLS-DA)寻找大黄牡丹汤治疗IBD大鼠的潜在代谢标志物并筛选其靶标代谢途径。结果,我们在TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠血清中发现并最终鉴定了与该模型密切相关的8个生物标志物可能与大黄牡丹汤治疗IBD大鼠作用机制相关。经相对含量差异分析,与正常组相比,TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠的潜在代谢标志物含量异常变化,经大黄牡丹汤干预后,其潜在的代谢标志物的含量呈现出不同程度的回调并接近正常组。在尿液代谢组学研究中,我们在TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠尿液中发现并最终鉴定了 6个与该模型大鼠尿液代谢关系密切的生物标志物,大黄牡丹汤对这6个尿液代谢生物标志物有显著调节的作用。通过MetPA代谢途径分析,结果表明这些潜在代谢标志物涉及的代谢途径主要有甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;鞘脂代谢;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;色氨酸代谢;苯丙氨酸代谢;嘌呤代谢;胆汁酸生物合成等代谢途径。本研究基于UPLC-Q/TOF-MS/MS技术,阐明了大黄牡丹汤的主要化学物质基础并揭示了大黄牡丹汤吸收入血的5个主要成分的药代动力学特征。研究发现大黄牡丹汤对TNBS/乙醇诱导的IBD大鼠有良好的治疗作用,并从代谢组学层面揭示其治疗IBD的作用机制。
【图文】：

黄素,质谱,大黄酸,负离子

５６号峰（ｔＲ＝１８．２３邋ｍｉｎ）、５８号峰（ｔＲ＝１９．３４邋ｍｉｎ）、６１邋号峰（ｔＲ＝２２．１５邋ｍｉｎ）、６３号峰（ｔＲ＝２４．９９逡逑ｉｎ）通过与对照品的保留时间及质谱信息比对，结合文献报道Ｒｌ，确定这些峰分别为游离蒽逡逑类化合物芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚。其中大黄素的结构解析规律见图２－２。逡逑６２号峰（ｔＲ＝２３．５６邋ｍｉｎ）通过与对照品的保留时间及质谱信息比对，结合文献报道确定逡逑二蒽醌类化合物大黄素甲醚。逡逑２４号峰（１（＾７．３４１１１丨１１）在负离子模式Ｆ的加和离子ｗ／ｚ４４５．０８４１，为准分子离子峰逡逑算分子式为Ｃ＾ＨｍＯｈ。在二级质谱中［Ｍ－Ｈ】？发生裂解依次掉落一分子葡萄糖即为Ｗ／ｚ逡逑８３．０３４８邋［Ｍ－Ｈ－Ｇｌｃ］％该碎片正好是大黄酸的分子离子峰，结合文献报道【％，故推测为大黄酸逡逑－０－葡萄糖苷，，其在负离子模式下的质谱裂解规律见图２－３。同理，４６号峰（ｔＲ＝１３．７０邋ｍｉｎ）应逡逑大黄酚葡萄糖苷。逡逑５５号峰（ｔＲ＝１７．９８邋ｍｉｎ）在负离子模式下的加和离子／ｎ／ｚ邋２９７．０４０３邋［Ｍ－Ｈ］＇邋ｉ十算分子式为逡逑ｍＨｍａ、。二级碎片为ｗ／ｚ２５３．０５００和２２５．０６０２，分别对应［Ｍ－Ｈ－Ｃ０２］＿和［Ｍ－Ｈ－Ｃ２0３］？，据文献１１７１逡逑

黄酸,硕士学位论文,质谱,准分子离子

广州中医药大学２０１９届硕士学位论文逦逡逑６０号峰（ｔＲ＝２１．３１ｍｉｎ）在负离子模式下的加和离子Ｗ／Ｚ３１１．０５５２，为准分子离子峰［Ｍ－Ｈ］＿，逡逑算分子式为ｃＩ７ｈＩ２ｏ６，分别对应［ｍ－ｈ－ｃ２ｈ２ｏ］－和［ｍ－ｈ－ｃ３ｈ３ｏ２］－，结合文献［｜７１推测为逡逑，５－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－９，１０－ｄｉｏｘｏ－９，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）邋ｍｅｔｈｙｌ邋ａｃｅｔａｔｅ0逡逑
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】