鄂西北地区4种柴胡属植物分子鉴别及柴胡药材活性成分近红外定量方法研究

发布时间：2020-05-09 18:56

【摘要】：目的:本研究旨在运用DNA条形码、高分辨熔解曲线、HPLC和近红外光谱四种技术对鄂西北地区柴胡种及质量两方面进行分析,为柴胡种快速鉴别和质量分析提供研究基础。方法:(1)采集鄂西北地区柴胡属植物北柴胡、狭叶柴胡、竹叶柴胡和三岛柴胡等4种植物样品。提取植物总DNA利用ITS序列和psbA-trn H序列PCR扩增,产物测序结果经CodonCode Aligner 9.5软件进行拼接,MEGA6.06软件对最终序列进行分析,基于K2P模型构建NJ树。(2)将4种12份柴胡属植物DNA样品,用ITS2通用引物建立柴胡熔解曲线模型,并对4种柴胡属植物进行定性鉴别。(3)收集市场销售柴胡药材48批HPLC法测定柴胡皂苷a、d含量,考察柴胡质量(4)对58批柴胡药材进行近红外光谱采集,以HPLC法测定柴胡皂苷a、d含量数据作为参考,首先使用K-S算法将58批柴胡样品划分为训练集和验证集,筛选出光谱最佳预处理方法,特征谱段以及SVM模型优化方法。分别利用PLS算法和SVM算法将训练集柴胡药材近红外光谱数据分别与柴胡皂苷a、d含量参考值进行匹配,建立定量分析回归模型。结果和结论:(1)鄂西北柴胡属植物ITS序列长度在534-536bp,种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离。4种柴胡属植物NJ树各为独立一支,均能得到良好区分。psbA-trnH序列长度在443bp左右,种内最大遗传距离大于种间最小遗传距离,无法用于鉴别4种柴胡属植物。因此ITS序列作为DNA条形码,对鄂西北4种柴胡属植物具有良好的鉴别能力。(2)4种柴胡属样品进行HRM实验分析,发现4种柴胡属DNA样品熔解曲线均为单峰且各种样品Tm值彼此分开。北柴胡熔解曲线Tm为(89.40±0.04)℃;狭叶柴胡熔解曲线Tm为(89.97±0.07)℃;竹叶柴胡熔解曲线Tm为(89.28±0.04)℃;三岛柴胡熔解曲线Tm为(89.74±0.08)℃。利用此模型,比较熔解曲线峰型和Tm值即可对4种柴胡属植物进行鉴别。(3)实验结果表明,除4、9、30号样品外,其他样品柴胡皂苷a、d总含量均符合《中国药典》(2015版)规定的标准(4)近红外定量分析柴胡确定了:以FD+MSC为预处理方法,8750~6000cm-1范围光谱为最佳谱段,网格寻优法为最佳优化方法的柴胡皂苷a定量分析模型;无预处理光谱,以8750~6000cm-1,4500~4100cm-1为最适谱段,GA法为最佳优化方法的柴胡皂苷d定量分析模型。两个分析模型RMSECV值分别为1.2471和1.4956,对柴胡皂苷a、d的定量分析有很好的鉴别精度和预测能力,可用于柴胡含量测定的快速鉴别。
【图文】：

在电炉上加热使溶液变澄清，间断煮沸 2-3 次，取下放置稍冷后入制胶床中，如出现气泡，可用移液枪枪头挑破，插入梳子，注意梳子制胶盒底部的距离，太近容易点样时不小心戳穿，静置冷却，等凝胶凝完全后轻轻拔去梳子，并将凝胶放于装有 1×TAE 溶液的水平电泳槽中待用。2.1.3 总 DNA 检测本实验所用的染色剂为 SYBR Green I 的 1%的稀释液和 6× loadbuffer 以 1:2 的比例配成，取 5μL 提取的样品总 DNA 与 2μL 染色剂混后加入到 1.0%的琼脂糖凝胶的点样孔中，在装有 1×TAE 电泳缓冲液的泳槽中以 5V/cm 的电压电泳 1 小时，将凝胶置于紫外灯下，观察到有显条带，见图 1-1。吸取样品总 DNA1.5μL 上超微量紫外分析仪测定浓及质量，详见表 1-2.将样品总 DNA 放置于-20℃冰箱保存。

湖北中医药大学 2017 届硕士学位论文PA/TH 引物的 PCR 扩增程序为 95℃预变性 4min，94℃变性 30s，55 1min，，72℃延伸 1min，35 个循环，72℃延伸 10min，10℃保温。 PCR 产物检测取扩增产物 5μL 与核酸染料 2μL（Sybra Green I 的 1%稀释液ding buffer=1:2）混合后加入到 1.0%琼脂糖凝胶的点样孔中，电泳后将凝胶置于紫外灯下观察，将有明显条带的扩增产物置于 4℃冰时保存，送检，如图 1-2 所示。产物条带模糊或者没有条带的样品扩增，甚至重新提取样品的 DNA。PCR 产物送交上海生工生物工程股份有限公司测定，以 5af/4RH 引物为测序引物，进行 DNA 序列的双向测定，以保证测定序列性。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.1

【参考文献】

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本文编号：2656584