【摘要】：大量文献报道肥胖为“慢性低度炎症状态”,诱导包括膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)在内多种疾病。KOA在中医理论中属“骨痹”范畴。《素问·痹论》指出:“风、寒、湿三气杂至,合而为痹”。目前关于膝关节骨性关节炎的中医辨证主要在虚实两证。现代医学发现肥胖会增加KOA发生率,且KOA患者髌下脂肪垫(Infrapatellar fat pad,IPFP)与炎症发生密切相关,但其内在分子机制不明确。研究发现,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、瘦素(Leptin)、脂联素(Adiponectin)与关节软骨基质退变和IPFP的炎症反应均相关,而且核转录因子NF-κB信号通路在维持组织的炎症反应方面具有关键作用。中药青风藤又称为大风藤、吹风散、青防已等,其单体青藤碱(sinomenine,SN)具有抗炎、镇静、镇痛、免疫调节作用。国内学者在OA研究中发现SN具有抗炎和抗软骨细胞凋亡作用。基于以上研究,本论文基于NF-κB信号通路探讨IPFP在肥胖KOA中作用机制及SN抗软骨细胞炎性损伤的分子机制研究。实验一炎症因子和脂肪因子在肥胖KOA患者关节液及血清中分布及肥胖临床特征相关性研究目的:研究炎症因子和脂肪因子在肥胖KOA患者关节液及血清中分布及肥胖临床特征相关性。方法:收集肥胖(Obese)和非肥胖(Lean)KOA患者的关节液和血清。使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者关节液和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin水平,并分析关节液和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、Leptin水平与BMI、年龄、性别、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、CRP、ESR相关性。结果:KOA患者的BMI与关节液和血清中IL-6正相关(P0.05),BMI与关节液中Leptin和TNF-α正相关(P0.05);KOA患者的VLDL-C与关节液IL-6正相关性(P0.05);KOA患者血清Leptin水平和血清IL-6、IL-1β具有正相关性(P0.05);KOA患者血清中TNF-α分别和血清中IL-6,IL-1β,及Leptin均具有显著正相关性(P0.05)。小结:Obese KOA患者的体重与其关节液中Leptin和TNF-α具有正相关性,确定关节腔内炎症水平和肥胖具有密切关联。实验二肥胖KOA患者髌下脂肪垫组织中细胞因子表达变化和分布目的:探讨IPFP不同部位(靠近滑膜侧和靠近髌腱侧)在骨性关节炎中作用,定位并定量分析与骨关节炎退变密切相关的细胞因子的表达。方法:收集肥胖(Obese)和非肥胖(Lean)KOA患者的皮下脂肪组织I、IPFP组织(靠近滑膜侧Ⅱ和靠近髌腱侧Ⅳ)、髌上脂肪垫组织Ⅲ。使用苏木精-伊红(HE)观察形态学差异。RTqPCR和Western blot检测IL-1β,IL-6,TNF-α、Leptin,Adiponectin,Visfatin和PPARγ在Obese和Lean患者的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组织中表达水平差异;免疫组织化学观察IL-1β,IL-6,TNF-α、Leptin、PPARy在Obese 和Lean患者的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组织中定位变化。结果:Obese KOA患者中,IPFP近滑膜侧和髌腱侧中IL-1β表达水平都高于其他组织(P0.05);IPFP近滑膜侧IL-6表达水平低于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05),但IPFP组织中近滑膜侧IL-6的mRNA水平高于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05);IPFP中靠近滑膜侧的TNF-α表达水平低于近髌腱侧IPFP(P0.05),二者都高于其他脂肪组织(P0.05);IPFP近滑膜侧的Leptin蛋白水平低于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05),靠近滑膜侧的mRNA水平高于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05);IPFP中靠近滑膜侧的Adiponectin的表达水平低于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05),但二者都高于其他脂肪组织(P0.05);与IPFP比较,Visfatin在IPFP中表达增高(P0.05)。IPFP中靠近滑膜侧的PPARy的表达水平低于近髌腱侧IPFP和其他组织(P0.05),但二者都高于其他脂肪组织(P0.05)。与Lean组相比,Obese组IPFP组织中炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α的转录和蛋白水平在IPFP组织中均比Lean组高(P0.05);与Lean组相比,Obese组中Leptin蛋白水平上调(P0.05);Visfatin和PPARy的水平有下调(P0.05);Adiponectin的表达水平的差异无统计学意义(P0.05)。免疫组织化学结果为Obese KOA患者的II和IⅣ组中Leptin阳性率高于Ⅰ和Ⅲ组;与Lean组相比,Obese组Leptin在IPFP组织中阳性表达率增高,Obese组PPARy在Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四组组织中阳性表达无差异。小结:1)Obese KOA患者IPFP近滑膜侧的IL-6、TNF-α、Leptin、Adiponectin的水平都低于近髌腱侧;2)Obese KOA患者IPFP组织中IL-1β,IL-6,TNF-α、Leptin水平都高于Lean组。实验三肥胖KOA患者髌下脂肪垫组织中不同部位的NF-κκB信号通路研究目的:进一步探讨IPFP不同部位(靠近滑膜侧和靠近髌腱侧)炎症反应激活和关节软骨降解的相关机制,研究NF-κB信号通路在肥胖KOA患者的IPFP中激活状况。方法:收集同实验二的组织,使用RTqPCR和Western blot检测NF-κB信号分子IκBα、IKKβ、p-P65(S536)以及细胞因子信号抑制剂SOCS-3的表达水平;免疫荧光标记检测KOA患者皮下组织、IPFP和髌上脂肪垫组织中p-P65的核易位。结果:Obese KOA患者的IPFP的IκBα表达下调,对比Lean组,Obese组中皮下脂肪组织,IPFP近滑膜侧,髌上脂肪垫组织的IκBα均表达降低(P0.05)。IKKβ和p-P65(S536)水平恰好与IκBα相反,IPFP组织中p-P65和IKKβ表达升高,且Obese高于Lean组(P0.05)。与Lean组相比,Obese组中SOCS-3水平均下降(P0.05),Obese KOA的IPFP近滑膜侧中SOCS-3的表达明显低于Lean组(P0.05)。SOCS-3在IPFP的Obese组中阳性率比Lean组减少。小结:Obese KOA患者IPFP组织中NF-κB信号通路激活高于Lean组织,SOCS-3水平低于Lean组织。实验四基于NF-κB通路的SOCS-3和Leptin信号的互作机制初探目的:研究脂肪细胞NF-κB通路激活与脂肪代谢信号的互作机制。利用小鼠胚胎成纤维细胞前脂肪细胞系3T3-L1探索SOCS-3与Leptin信号的互作关系。方法:于ATCC购买前脂肪细胞系3T3-L1。使用1.5μg10ng/ml NF-κB激活剂IL-1β刺激3T3-L1细胞0h、1h、2h。建立过表达SOCS-3的重组载体(pcDNA\SOCS-3)1μg,2μg,5μg的 pcDNA\SOCS-3或pcDNA\null分别转染3T3-L1细胞24h。pcDNA\SOCS-3载体联合Leptin刺激细胞3T3-L1。Western blot检测NF-κB信号分子 IκBα、IKKβ、p-P65(S536)以及RTqPCR和Western blot细胞因子信号抑制剂SOCS-3的表达水平;免疫共沉淀检测Leptin/Leptin受体与SOCS-3的结合状况。结果:IL-1β刺激3T3-L1细胞激活NF-κB信号通路,并抑制SOCS-3的表达(P0.05);pcDNA\SOCS-3组中SOCS-3呈剂量依赖性上调(P0.05),而Leptin受体的表达水平降低(P0.05)。Leptin+pcDNA\SOCS-3细胞组中Leptin受体表达部分增加(P0.05),而且IKKβ和p-P65的表达水平都部分增加(P0.05),IκBα的表达水平部分减少(P0.05)。在3T3-L1细胞中我们检测到较高水平的SOCS-3-Leptin受体复合物,(P0.05),未检测到SOCS-3-Leptin复合物。小结:在3T3-L1细胞中IL-1β刺激均可激活NF-κB信号通路,且抑制SOCS-3;SOCS-3过表达抑制3T3-L1细胞中Leptin受体表达和NF-κB信号通路的激活;3T3-L1细胞中SOCS-3通过直接与Leptin受体结合调节NF-κB信号通路。实验五青藤碱保护大鼠膝关节软骨细胞的炎性损伤的功能和机制研究目的:探索抗炎中药组分青藤碱(SN)通过调节NF-κB信号通路对炎症因子诱导的软骨细胞损伤的保护作用和机制。方法:原代分离新生SD大鼠的软骨细胞。SN(0,50,100,150,200,300,400,600,800,1000μM)刺激软骨细胞,使用CCK8法检测细胞增殖活性变化。使用1.5μg 10ng/ml NF-κB激活剂IL-1β刺激软骨细胞RTqPCR和Western blot检测p-P65水平;免疫荧光检测p-P65(S536)核易位;RTqPCR和Western blot检测MMP-3和MMP-9的表达变化。使用1.5 μg 10 ng/ml NF-KB激活剂IL-1β联合使用50,100,200,300 μM的SN激软骨细胞RTqPCR和Western blot检测p-P65水平;免疫荧光检测p-P65(S536)核易位;RTqPCR和Western blot检测MMP-3和MMP-9的表达变化。结果:原代分离的软骨细胞阳性率接近100%。SN对软骨细胞的增殖具有抑制作用。IL-1β可诱导MMP-3和MMP-9的表达增高(P0.05),并可被SN显著抑制(P0.05)。110ng/ml IL-11β处理细胞2h发现p-P65(S536)的水平增高,SN对此p-P65(S536)的水平增高具有抑制作用(P0.05)。小结:SN在广泛的浓度范围内抑制软骨细胞的增殖活性。MMP-3和MMP-9信号是SN保护软骨细胞炎症损伤的潜在靶点。抑制NF-κB信号通路的激活是SN保护软骨细胞炎性损伤的下游分子机制之一。SN通过抑制NF-κB信号通路的激活,调节软骨细胞的生长活性及细胞外基质降解关键蛋白酶MMP-3和MMP-9的表达,对炎性损伤的软骨细胞具有重要保护作用。研究结论:IPFP组织中NF-κB信号通路激活介导的促炎反应和脂肪代谢紊乱是肥胖KOA发展过程中关键特征;青藤碱具有保护软骨细胞免受因炎症异常激活导致的降解的作用。
【图文】：
图１－１邋ＥＬＩＳＡ试剂盒标准曲线逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖ；ｅ邋ｏｆ邋ＥＬＩＳＡ邋ｋｉｔ逡逑统计分析逡逑将获取的实验数借助ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计学分析。统计属于正态分布的计量组之间的差异使用Ｔ检验。对于计数资料的组间比较，采用卡方检验。两个变量相关性分析，在ＳＰＳＳ１７．０统计两组变量有无相关性。检验时，当Ｐ＜０．０５，认为学差异。逡逑果逡逑患者的一般人口学资料及检测指标水Ｔ？变化逡逑如本研宄共初选纳入ＫＯＡ患者共２５例，男８例，女１７例（表１－３），其中性别为：男性３２％，女性６８％，女性分布显著性高于男性（表１－４，邋ＰＣ０．０５）。逡逑
Ｏｂｅｓｅ邋，，逦，、，，．：’：’、▲逦’逦．逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｈ＆Ｅ邋ｓｔａｉｎ邋ｏｆ邋ＩＰＦＰ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑图２－１邋ＩＰＦＰ组织的ＨＥ染色图逡逑２．２肥胖ＫＯＡ患者髌下脂肪垫组织特征变化逡逑使用ＨＥ染色研宄肥胖ＫＯＡ患者ＩＰＦＰ组织（ＩＩ，ＩＶ）与皮下脂肪组织（Ｉ）和髌上脂逡逑肪垫组织（ＩＩＩ）形态特征变化。结果显示，与皮下脂肪组织及髌上垫脂肪组织相比，髌逡逑下脂肪垫组织中脂肪细胞形态未见明显差异。（图２－２）。逡逑ｒ邋．逦’？逦－逦，逦、逦？…，Ｋ逡逑１邋：，NB，，．Ｖ邋＂Ｓ１１、…逡逑．ｖ丫邋、邋．ｎ邋、逡逑ＩＩＵ；逦；逦？逡逑ＩＨＨ邋ｆＫｍｍ逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ｈ＆Ｅ邋ｓｔａｉｎ邋ｏｆ邋ｆａｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｂｅｓｅ邋ＫＯＡ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑图２－２肥胖ＫＯＡ患者关节内脂肪组织的ＨＥ染色图⑴皮下脂肪组织，（ＩＩ）邋ＩＰＦＰ靠近滑膜侧，（ＩＩＩ）逡逑髌上脂肪垫组织；（ＩＶ）邋ＩＰＦＰ近髌腱侧逡逑６６逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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