二氢杨梅素通过调节肠道菌群结构防治肥胖及胰岛素抵抗的作用机制研究

发布时间：2020-05-10 09:50

【摘要】：肥胖是一种系统慢性炎症性疾病,也是导致胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病的主要危险因素。如今随着大众生活水平的提高,高脂饮食及长期缺乏运动等不良生活饮食习惯已成为引发肥胖及胰岛素抵抗的最主要原因,而肠道菌群在此过程中扮演着重要角色。作为我国传统医学的瑰宝,中药在防治肥胖及胰岛素抵抗方面的药效作用不断得到证实,其作用机制也与调节肠道菌群结构密切相关,已引起国际相关研究领域的广泛关注。藤茶是我国传统的药食两用植物,具有“清热解毒、利湿消肿、平肝降压、活血通络”等功效。二氢杨梅素作为藤茶的活性指标成分,在防治肥胖及胰岛素抵抗方面具有潜在的临床应用前景,其作用机制值得深入系统研究。因此,本文首次从肠道菌群角度着手,以阐明二氢杨梅素通过调节肠道菌群结构防治肥胖及胰岛素抵抗的作用机制为研究目标,整体研究内容共分为以下五个章节:第一章二氢杨梅素大鼠体内药代动力学研究目的:考察二氢杨梅素口服给药后的大鼠体内药代动力学基本特征。方法:采用LC-MS/MS技术,建立二氢杨梅素在大鼠血浆中的LC-MS/MS含量测定方法,并进行系统方法学验证。采用所建立的含量测定方法,分析右旋及消旋二氢杨梅素口服给药后的血药浓度经时变化情况,并对其药代动力学参数进行分析比较。结果:系统方法学验证研究结果表明,所建立的二氢杨梅素在大鼠血浆中的LC-MS/MS含量测定方法符合生物样品分析要求。在达峰时间(160±90.3及36.7±41.7 min)、药时曲线下面积(42.8±5.92及32.0±9.03 mg×min/L)、表观分布容积(1001±349.5及1721±660.9 L/kg)方面,两组间有显著性差异。但在达峰浓度、半衰期、药时曲线下面积、清除率、平均滞留时间方面,两组间无显著性差异。结论:从整体结果上看,右旋及消旋二氢杨梅素口服给药后血药浓度均较低,且消除迅速,并可能大量分布于全身各组织器官中,有待进一步的组织分布及排泄状况研究确认。第二章二氢杨梅素大鼠体内组织分布与排泄状况研究目的:考察二氢杨梅素口服给药后在大鼠体内的组织分布及排泄状况,为后续有关二氢杨梅素的药效及其作用途径研究提供理论依据。方法:采用LC-MS/MS技术,建立二氢杨梅素在大鼠组织、尿液及粪便中的LC-MS/MS含量测定方法,并进行系统方法学验证。采用所建立的含量测定方法,分析二氢杨梅素口服给药后各组织、尿液及粪便样本中的药物浓度随时间变化情况。结果:系统方法学验证研究结果表明,所建立的二氢杨梅素在大鼠组织、尿液及粪便中的LC-MS/MS含量测定方法符合生物样品分析要求。口服给药后各组织中二氢杨梅素分布浓度在15 min或45 min时达到峰值,胃组织及小肠组织药物分布浓度峰值明显高于其它组织。给药45 min后,各组织中药物分布浓度随时间变化呈现快速下降趋势,12 h后下降幅度均超过90%。二氢杨梅素通过尿液及粪便累计排泄量随时间变化不断升高,并在12 h时达到峰值;二氢杨梅素通过尿液的累计排泄量仅为0.0145±0.0069%,但通过粪便的累计排泄量可达到18.95±6.87%。结论:二氢杨梅素口服给药后可快速分布于全身各组织,且消除迅速,二氢杨梅素原型成分主要分布于胃肠道中。二氢杨梅素原型成分主要通过粪便排泄,且大部分原型成分主要通过代谢产物形式排出体外。结合本章及课题组同期有关二氢杨梅素的体内代谢研究,整体研究结果表明口服给药后的二氢杨梅素原型成分及其代谢产物均难以吸收入血,并最终通过肠道以粪便形式排出体外。第三章二氢杨梅素防治肥胖及胰岛素抵抗的药效系统评价及初步机制研究目的:系统评价二氢杨梅素防治高脂饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗的药效作用,并从代谢性内毒素血症及其引发的系统慢性轻度炎症角度,探索研究二氢杨梅素防治肥胖及胰岛素抵抗的作用机制。方法:采用高脂饮食诱导建立小鼠肥胖及胰岛素抵抗模型,分别在造模开始时及造模成功后,进行低中高剂量二氢杨梅素灌胃给药,系统评价二氢杨梅素对肥胖及胰岛素抵抗的预防及治疗作用。在此基础上,检测血清LPS水平、肝脏及附睾脂肪组织促炎细胞因子m RNA水平(IL-1β、IL-6、TNF-α)、回肠及结肠组织中肠道渗透性标志物m RNA水平(ZO-1、Occludin),考察二氢杨梅素对代谢性内毒素血症及其引发系统慢性轻度炎症的改善作用。结果:低中高剂量二氢杨梅素可不同程度降低体重增长水平、体脂水平、肝脏重量及其脂质含量、附睾脂肪重量及其细胞大小、空腹血糖及血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、葡萄糖及胰岛素耐量试验曲线下面积,发挥预防及治疗高脂饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗的药效作用。二氢杨梅素在发挥治疗作用时具有剂量依赖性,而在发挥预防作用时未见剂量依赖性。在二氢杨梅素干预后,高脂饮食诱导的血清LPS水平以及肝脏及附睾脂肪组织中的促炎细胞因子m RNA水平显著降低,回肠及结肠组织中的肠道渗透性标志物m RNA水平显著升高。结论:二氢杨梅素可通过维持肠道屏障完整性及降低透过肠道屏障进入血液循环的LPS水平,减轻代谢性内毒素血症及其引发的系统慢性轻度炎症反应,从而发挥防治高脂饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗的药效作用。二氢杨梅素在分别发挥预防及治疗作用时的量效关系研究结果,为中药量效关系的“毒物兴奋效应”观点提供了实验依据。第四章二氢杨梅素干预下的肠道菌群结构变化研究目的:全面分析在预防及治疗肥胖及胰岛素抵抗过程中,二氢杨梅素对肠道菌群结构的具体调节作用。方法:采用16S r RNA基因测序技术结合生物信息学分析手段,包括OTU分析及物种注释、样本复杂度分析、多样本比较PCo A分析、STAMP分析等,全面分析二氢杨梅素干预后的肠道菌群结构多样性变化以及不同分类水平下的肠道菌群种类及相对丰度变化。结果:α多样性指数及PCo A分析结果显示,二氢杨梅素可不同程度改变肠道菌群结构多样性。二氢杨梅素可提高拟杆菌门与厚壁菌门的相对丰度比值,其作用体现出剂量依赖性。不同分类水平下的STAMP分析结果显示,二氢杨梅素可针对性调节高脂饮食诱导下出现相对丰度变化的特定菌群种类。结论:在预防及治疗肥胖及胰岛素抵抗过程中,二氢杨梅素可对肠道菌群结构多样性进行调节,并针对性调节与肥胖及胰岛素抵抗发生发展及防治密切相关的肠道特定菌群种属。第五章二氢杨梅素通过调节肠道菌群结构防治肥胖及胰岛素抵抗的深入机制研究目的:确证二氢杨梅素对肠道菌群结构的调节作用是其防治肥胖及胰岛素抵抗的药效作用途径,进一步筛选确认与肥胖及胰岛素抵抗密切相关的肠道特定菌群种属。方法:在高脂饮食诱导建立肥胖及胰岛素抵抗小鼠模型造模开始时,采用混合抗生素剔除肠道菌群,然后进行二氢杨梅素给药干预,通过药效系统评价方法考察二氢杨梅素药效作用是否消失。在此之后,停止混合抗生素干预,并采用肠道菌群移植手段,重新引入高脂饮食状态下的肠道菌群,继续进行二氢杨梅素给药,通过药效系统评价方法考察二氢杨梅素的药效作用是否重新恢复。在此研究基础上,通过肠道菌群结构分析,进一步筛选确认与肥胖及胰岛素抵抗发生发展及防治密切相关的肠道特定菌群种属。结果:肠道菌群剔除后二氢杨梅素的药效作用消失;停止混合抗生素干预并重新引入高脂饮食状态下的肠道菌群,可加快肥胖及胰岛素抵抗的发生发展;在移植高脂饮食状态下的肠道菌群后,继续进行二氢杨梅素给药,发现二氢杨梅素的药效作用恢复。肠道菌群结构分析研究结果表明,在二氢杨梅素干预下,肠道特定菌群种属如Mucispirillum、Roseburia、Faecalibacterium菌属相对丰度出现显著改变,其中Mucispirillum菌属相对丰度显著降低,而Roseburia、Faecalibacterium菌属相对丰度显著升高。结论:本章探索性采用肠道菌群剔除及肠道菌群移植相结合的因果关系验证方法,确证了二氢杨梅素对肠道菌群的调节作用是其防治肥胖及胰岛素抵抗的药效作用途径,表明二氢杨梅素可通过针对性调节肠道特定菌群种属而发挥防治肥胖及胰岛素抵抗的药效作用。在此基础上,进一步筛选确认出与肥胖及胰岛素抵抗发生发展及防治密切相关的肠道特定菌群种属,包括Mucispirillum、Roseburia、Faecalibacterium菌属。
【图文】：

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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】