三七和三七素改善糖尿病肾病肾损伤的作用及其机制研究

发布时间：2020-05-11 15:34

【摘要】：研究背景及目的近30年来,我国糖尿病患病率升高了17倍,受到了人们的广泛关注。而伴随糖尿病的诸多并发症也对人类健康造成了严重的威胁,其中糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病诸多并发症中最严重,也是致死率最高的一种,在I型和II型糖尿病患者中均可发生,其发病率分别为15-25%与30-40%。DN也是慢性肾病死亡的主要原因,大概占全世界终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的50%。从西医角度来看,DN的主要临床表现为蛋白尿,特殊的肾脏形态学及功能的改变。其主要病理特征是肾小球系膜细胞和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)聚积,肾小球基底膜弥漫性增厚,进而造成结节性肾小球硬化。其病机目前尚未完全阐明,但多数研究表明,DN的发生和发展是长期高血糖环境下多因素综合作用的结果,是在主要基因效应、平均基因效应和多基因或微小基因这三种易感性上,氧化与抗氧化作用失衡,使氧化产物增多,糖脂代谢紊乱、血液变形和流动异常、血管舒缩物质、具有生物学效应的小分子蛋白物质和活性细胞因子等多种因素共同作用,导致的慢性肾损伤。主要表现为肾小球系膜细胞增生、细胞外基质增多,胶原分泌增加,导致肾小球高灌注、高滤过,进而导致肾小球肥大,肾滤过肾功能受损,大量蛋白外漏,以致蛋白尿形成。从中医范畴来讲,DN既属消渴病,又属肾病。如历代医家所述,消渴继发水肿、胀满、尿浊、关格等病症皆属肾病范畴。DN的中医病机是肾虚兼挟血瘀;糖尿病各种合并症皆为阴虚血瘀;瘀血阻络是DN的一个特点,气虚血瘀、水湿内停是其基本病机;又有人在强调气阴虚损的同时,更重视瘀结。总之,DN是在糖尿病气阴两虚基础上发展而来,久病必瘀,久病必虚,久病及肾,脾肾两虚,水液输布失常,气化不利所致。可见,DN的落脚点在瘀,中医对DN的基本治疗原则也是活血化瘀。我们通过查阅文献,发现以“活血止血之神药”和“止血而不留瘀”闻名的中药三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)在中医治疗肾病方面有着悠久和广泛的用药历史。而我们的预实验也发现三七及其水提物能够抑制肾小球系膜细胞增殖和胶原分泌。本文结合中医对DN的认识和西医对DN病理特征的描述,以抑制肾小球系膜细胞增生和抑制胶原分泌为指标,从化瘀类中药三七中筛选出能显著抑制肾肾小球系膜细胞增殖和抑制胶原分泌的成分三七素(dencichine,De),并对其进行体内外活性评价,对De改善DN中肾损伤的机制进行了探讨。研究方法首先,以高糖-DMEM培养基模拟糖尿病体内高糖环境,培养大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1),造成DN细胞模型。以抑制HBZY-1增生和抑制胶原分泌为指标,通过CCK-8、胶原染色的方法从三七的10种含量较高的有效成分中筛选出能显著抑制HBZY-1增殖和抑制胶原分泌的成分De。并通过MTT、ELISA和免疫荧光等方法对De抑制HBZY-1细胞增殖和抑制胶原分泌和聚积进行了体外实验验证。其次,高脂高糖饲料喂养,并结合45 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),以连续检测三次随机空腹血糖16.7 mmol/L,同时尿蛋白阳性视为评判指标,造成II型DN大鼠模型。同时,分别给予Met、De和三七处理9周,随时监测一般体征和空腹血糖,于第9周末检测口服糖耐量后麻醉取血,检测生化指标、胰岛素水平、糖化血红蛋白水平和肾功能等,最后处死大鼠,取肾和胰腺称重后固定或-80℃冷藏,进行病理学检测和蛋白分析。再次,采用ELISA、PCR、免疫组化、免疫荧光和Western Blot等方法分别检测肾组织中I型胶原(Collagen I,Col-I)、IV型胶原(Collagen IV,Col-IV)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和层黏连蛋白(laminin,LN)等ECM主要成分及其降解相关酶MMP-9和TIMP-1的表达,同时检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、钙黏附蛋白(E-cadherin,E-Cad)和波形蛋白(vimentin)等上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的表达,从减少ECM和改善EMT两个方面评价三七和De改善肾损伤的作用机制。最后,采用Western blot和Rt-PCR技术检测De对TGF-β/Smad信号通路相关蛋白TGF-β1、Smad2/3和Smad7表达的影响,并探讨可能存在的信号调控通路及其分子作用机制。研究结果1三七中主要成分De对HBZY-1细胞增殖及其对总胶原和ECM聚积和降解的影响三七中主要成分De在1×10~(-3)、1×10~(-4)和1×10~(-5) M可显著抑制HBZY-1细胞增殖,且作用优于三七中其他8种皂苷类和1中黄酮类成分,也优于三七超细粉溶液。表明De能显著抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖和胶原分泌,其作用也优于其他9种成分。进一步研究表明,De能降低高糖诱导的Col-I、Col-IV、FN和LN分泌,并能升高MMP-9/TIMP-1的比值,而促进ECM的降解。2三七和De纠正Ⅱ型DN中糖、脂代谢紊乱和改善肾损伤与模型组相比,De能改善DN大鼠的一般体征。生化检测结果表明,De能显著降低DN大鼠空腹血糖、胰岛素水平、糖化血红蛋白(HbAlc)含量和改善DN大鼠口服糖耐量;降低血清中总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL),并升高高密度脂蛋白(HDL);降低尿蛋白(Upro),尿素氮(BUN)和尿肌酐(UCr)水平,保护肾功能、改善肾脏和胰腺的病理性损伤;减少胶原和糖原在肾组织中的沉积,预防肾纤维化。3三七和De改善肾组织中ECM沉积和改善肾组织EMTDe能显著减少Col-I、Col-IV、FN和LN等ECM主要成分在肾组织中的表达,并显著升高MMP-9/TIMP-1的比值,以促进肾组织中ECM降解;此外,De还能显著降低α-SMA和Vimentin蛋白,同时升高E-Cad蛋白的表达。表明De能通过减少ECM在肾组织中聚积和抑制EMT,从而改善DN中的肾纤维化的发展。4 De通过抑制TGF-β/Smad信号通路缓解DN中肾损伤De能显著下调TGF-β/Smad信号通路中TGF-β1和Smad2/3的表达,并能显著上调该信号通路的内源性抑制剂Smad7的表达,揭示De可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路缓解DN中肾损伤的分子作用机制。研究结论1、证实了三七和De能显著改善Ⅱ型DN中肾损伤。三七和De能降低Ⅱ型DN大鼠24 h尿量和尿蛋白排泄、降低尿素氮和尿肌酐水平,减少胶原、糖原和ECM在肾小球的聚积,对DN引起的肾功能障碍和肾病理性损伤有显著的保护作用。2、发现三七和De能有效改善Ⅱ型DN大鼠糖、脂代谢。三七和De能降低Ⅱ型DN大鼠空腹血糖、胰岛素水平和糖化血红蛋白含量,并改善Ⅱ型DN大鼠口服糖耐量受损。3、确证了De是三七中治疗Ⅱ型DN的主要物质成分。体内外实验均证实三七和De能抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖,ECM聚积和胶原分泌,并能升高MMP-9/TIMP-1的比值,以促进ECM降解从而抑制肾小球肥大,其作用可与三七原药材作用相当;4、初步发现De能抑制Ⅱ型DN引起的肾纤维化进程。三七和De能降低肾组织中胶原的沉积,并降低α-SMA和Vimentin的表达,同时升高E-Cad蛋白的表达,提示其可能具有抑制Ⅱ型DN引起的肾纤维化作用。
【图文】：

信号通路,受体

.1 TGF 超家族及其信号转导TGF-β 受体（TβR）分为 3 种：TβR I、TβR II 和 TβR III，其中 TβR I、TβR种跨膜糖蛋白是 TGF-β 信号通路所必须的[63]。且只有两者共同在细胞膜表面时，才能将信号放大并传递给 TGF-β 反应的下游底物[64]。Smads 在 TGF-β 信号通路中起信号介导作用。在哺乳动物中发现了 8 种不同mads 蛋白，即 Smad1～Smad8，可分为 3 个亚族：受体激活的 Smads（R-Smad用型 Smads （Co-Smad）和抑制型 Smads （I-Smad）。其中 R-Smad 包括 Smad、3、5、8，Co-Smad 受体是 Smad4，I-Smad 包括 Smad6 和 Smad7。R-Smads 磷后能与 Co-Smad Smad4 形成异聚体复合物，转入进行基因转录。I-Smad 可以通竞争性抑制 R-Smad 的活化，促使受体泛素化使之降解，或与 TGF 活化激酶（ITA）协同干扰 BMP 诱导的 P38 的激活[65, 66]。TGF-β/Smad 信号通路成员和信号转意图如图 1 所示。

给药方案,细胞模型,葡萄糖,培养基

移至液氮中保存，并做好记录和编号。高糖诱导 DN 细胞模型采用含 30 mmol/L葡萄糖的高糖 DMEM 培养基培养 HBZY-1 细胞模拟糖尿环境，建立 DN 细胞模型。具体实验分组及给药详见图 3 和表 1。其中，正培养基为含 5.5 mmol/L 葡萄糖的低糖 DMEM 培养基（LG-DMEM），渗透为 5.5 mmol/L 葡萄糖的 LG-DMEM 配成的 24.5 mmol/L 甘露醇（MA）溶液物临用前，按 10 倍量稀释的方法，将母液逐倍稀释成 1 × 10-3，1 × 10-4，，1 × 10-6备用。实验分组及给药方案按图 3 所示，对细胞实验进行分组：
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】