枸杞多糖对糖尿病心肌病大鼠的保护作用

发布时间：2020-05-13 18:52

【摘要】：目的高糖诱导H9c2心肌细胞与链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠作为模型,探讨枸杞多糖(LBP)对糖尿病心肌病大鼠的保护作用。方法在含5%CO_2 37℃恒温孵箱中,用含10%胎牛血清、1%链霉素的低糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞。按照加药剂量将细胞分为9组:对照组;HG_1(50mM/l)组;HG_1+LBP(30μg/ml)组;HG_1+LBP(60μg/ml)组;HG_1+LBP(90μg/ml)组;HG_2(100mM/l)组;HG_2+LBP(30μg/ml)组;HG_2+LBP(60μg/ml)组;HG_2+LBP(90μg/ml)组。实验期间,LBP培养H9c2心肌细胞24小时后,高葡萄糖(HG)培养基继续诱导细胞24h,收集贴壁细胞和培养基,用MTT法检测H9c2心肌细胞存活力;用荧光染料二氢乙啶(DHE)染色法测定心肌细胞活性氧(ROS)的含量;评估细胞的损伤程度及抗氧化酶活性,检测细胞培养基或心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量或活性。从60只成年雄性SD大鼠中,随机选取50只大鼠连续5天进行腹腔注射STZ(50mg/kg),只有在一次注射STZ后72小时大鼠具有高血糖症(≥16.7mmol/l),被视为糖尿病模型制造成功,其余10只SD大鼠作对照组。将糖尿病大鼠随机分为三组(n=10):STZ组,STZ+LBP(60mg/kg/d)组和STZ+LBP(30mg/kg/d)组,枸杞多糖组灌胃持续12周,STZ组灌胃同体积的水,密切观察灌胃前后动物的健康状况。给药结束后,采用20%乌拉坦(1g/kg)麻醉各组大鼠,内眦静脉取血,测大鼠空腹血糖;称取大鼠体重、心脏和左心室重量,计算心脏重量/体重比(HW/BW)和左心室重量/体重比(LVW/BW);实时荧光定量PCR法测心脏组织内心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)mRNA的水平;用HE染色法观察心肌形态学的变化;检测血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的含量;蛋白印迹方法测定心脏组织中细胞间内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、钙蛋白酶-1(calpain-1)、TNF-α、IL-6、细胞间黏附分子(ICAM)-1、血管细胞粘附分子(VCAM)-1、Smad2/3、核因子-кB(NF-кB)和抑制蛋白кB(iкB)-α、磷酸化核因子-кB(P-NF-кB)和磷酸化抑制蛋白кB(P-iкB)-α蛋白的表达水平;免疫组化法测定组织中p65(NF-кB亚基)的核内转移量。结果(1)体外实验:与对照组相比,(1)HG_1和HG_2组H9c2心肌细胞存活力减少,分别至70.63%和60.54%;(2)HG组ROS的产生显著性增加;(3)HG组细胞培养液中LDH活力增加;(4)HG组心肌细胞内总抗氧化能力下降;(5)HG作用增加了MDA的浓度,减少了GSH的含量,降低了SOD、过氧化氢酶与GSH-Px酶的活性。与HG相比,(1)LBP作用不同程度地增加了细胞存活力;(2)LBP组细胞内ROS的产生减少;(3)LBP减少心肌细胞LDH的漏出量;(4)LBP改善细胞的总抗氧化能力;(5)LBP降低了心肌细胞MDA浓度,增加了GSH含量和抗氧化酶的活性。(2)体内实验:STZ组与空白组相比,(1)大鼠空腹血糖值明显增高,心脏重量/体重及左心室重量/体重比值增大,心脏组织中心肌细胞排列紊乱、心肌纤维束宽松;(2)心脏组织中ANP和BNP mRNA和蛋白的表达水平增加;(3)心肌中ROS产生明显增加;(4)心脏组织中SOD、CAT活性和GSH的含量降低,而MDA产生增加;(5)心脏组织中eNOS蛋白表达下调,iNOS蛋白表达上调;(6)血清中的IL-6与TNF-α含量及组织中IL-6与TNF-α的蛋白表达增加;(7)心脏组织中ICAM-1、VCAM-1、TLR4和smad2/3的蛋白表达上调;(8)心脏组织中calpain-1蛋白的表达增加;(9)心脏组织细胞核内NF-кB和P-NF-кB蛋白的表达量增加,细胞质iкB-α和P-iкB-α蛋白的表达量减少;(10)心脏组织中p65的核内转移量增加。STZ+LBP(60,30)组与STZ组相比,(1)大鼠空腹血糖值降低,但仍高于空白组;心脏重量/体重与左心室重量/体重比值降低,心肌组织细胞紊乱、纤维束宽松程度有所改善;(2)心脏组织中ANP和BNP mRNA和蛋白的表达减少;(3)心肌中ROS的产生减少;(4)心脏组织中SOD、CAT活性和GSH的含量增加,而MDA含量降低;(5)心脏组织中eNOS蛋白表达上调,iNOS蛋白表达下调;(6)血清中的IL-6与TNF-α含量及组织中IL-6与TNF-α的蛋白表达量降低;(7)心脏组织中ICAM-1、VCAM-1、TLR4和smad2/3的蛋白表达下调;(8)心脏组织中calpain-1蛋白表达量减少;(9)心脏组织细胞核内NF-кB和P-NF-кB蛋白表达含量减少,细胞质iкB-α和P-iкB-α蛋白含量增多;(10)心脏组织中p65入核转移减少。结论(1)LBP降低糖尿病大鼠的血糖值。(2)LBP减轻糖尿病大鼠心脏内氧化应激的的水平。(3)LBP对糖尿病心肌病大鼠具有保护作用,可能与枸杞多糖减轻氧化应激与炎症浸润,抑制calpain-1的活性和NF-кB的激活相关。
【图文】：

图1.1 LBP对心肌细胞Cell viability的影响数据表示为 x ±SEM，n=4，与control组相比#P <0.05，##P <0.01，与HG1组相比*P <0.05，**P <0.01，与HG2组相比★P<0.05，★★P<0.01。2、LBP减轻高糖诱导H9c2心肌细胞的氧化应激采用DHE染色法测定各组细胞内ROS的水平，代表性图片如图1.2A所示，与对照组相比，HG1和HG2组细胞ROS的产生显著性增加（图1.2B）；与HG组相比，使用LBP可以不同程度地减少细胞内ROS产生，同时，分别与HG1、HG2组相比，LBP（60和90μg/ml）减少细胞内ROS的产生，差异具有统计学意义，上述结果表明了LBP可以减轻细胞的氧化应激水平。

图1.2 LBP对心肌细胞内ROS产生的影响A：H9c2心肌细胞的代表性的乙锭荧光图像（×200）， B：ROS水平统计结果的相对荧光强度。数据表示为 x ±SEM，n=4，与control组相比#P <0.05，##P <0.01，与HG1组相比*P <0.05，**P <0.01，与HG2组相比★P<0.05，★★P<0.01。3、LBP降低高糖损伤H9c2心肌细胞上清液LDH水平LDH活力水平结果如图1.3所示，与对照组相比，HG1和HG2组细胞培养液中LDH活力显著性增加；与HG组相比，LBP减少了细胞中LDH的漏出量，分别与HG1、HG2组相比，LBP（60和90μg/ml）使细胞培养液中LDH的活力下降，，差异具有统计学意义，上述结果表明了LBP减轻了HG介导的细胞损伤。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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1 胡志斌;李U喢

本文编号：2662390