连翘苷减肥作用靶标的识别与验证

发布时间：2020-05-15 04:53

【摘要】：世界卫生组织明确将肥胖列为疾病的一种。肥胖可引发糖尿病、高血压、心功能受损、癌症等多种疾病,且对人类造成的威胁日益剧增,严重威胁着各个年龄段肥胖人群的健康。因此,对肥胖产生机制和治疗研究成为科研领域迫切渴望解决的难题。药物靶标是药物研发重中之重,为疾病治疗提供新途径,为药物筛选提供新突破口。近年来,科学领域不断发展,随之也产生了一些新兴的药物靶标找寻技术,给肥胖症患者带来了福音。本课题主要对连翘苷的减肥靶标进行了初步识别与验证。首先在细胞水平上对连翘苷的减肥作用进行了确认;其次运用网络药理学方法对连翘苷潜在减肥作用靶标进行预测;然后一方面用DARTS技术结合电泳实验找寻连翘苷靶标,另一方面用分子对接技术研究了连翘苷与PDE3B的相互作用;最后基于上述研究结果及文献调研推测连翘苷的减肥靶标可能为PDE3B,并分别从细胞水平与分子水平对其展开验证实验。主要研究内容和实验结果总结如下:1.连翘苷减肥作用确认。主要利用MTT法、荧光染色法进行研究。结果表明:当浓度为1-100μM时,连翘苷对HepG2细胞存活率无影响。用DMEM高糖培养基(30 mM D-glucose)孵育HepG2细胞,构建脂滴累积细胞模型,然后用不同浓度连翘苷孵育细胞,用尼罗红对HepG2肝细胞进行染色,发现HepG2细胞荧光强度随着连翘苷浓度(1.25、2.5、5μM)的增加有所减弱,当连翘苷浓度≥5μM时,HepG2细胞荧光强度基本保持不变。以上研究表明连翘苷能够抑制高糖诱导的HepG2肝细胞中脂滴的积累,即在细胞水平上连翘苷确实具有减肥作用。2.连翘苷潜在减肥作用靶标的虚拟筛选。采用网络药理学这一信息学手段进行靶标筛选。首先依据反向药效团匹配方法预测连翘苷靶点(成分靶点),然后与GeneCards与CooLGeN数据库筛选得到的肥胖靶点(疾病靶点)比对分析,采用Cytoscape软件构建靶点相互作用网络图,采用ClueGO软件对靶点进行GO分类富集分析与KEGG通路分析。结果表明:网络药理学分析中共得到27个连翘苷潜在减肥作用靶点,其中PDE3B即是27个靶点之一。GO分类富集中,生物过程分析表明其主要参与调节纤维细胞增殖、胰液分泌、一氧化氮介导的信号转导、超氧化物代谢、I-κB激酶/NF-κB信号传导、维甲酸受体信号、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、壳聚糖的分泌与运输等相关生物过程;分子功能分析表明相关靶点主要参与核受体活动,影响氧化还原酶活性,作为受体参与过氧化作用,与类视黄醇X受体结合等分子功能。KEGG通路分析表明,预测的靶点涉及小细胞肺癌通路与脂肪细胞脂解调控通路。3.连翘苷减肥作用靶标实验筛选。首先采用DARTS技术,结合SDS-PAGE电泳进行靶标识别,分别从链霉蛋白酶E的浓度、水解时长、水解温度等方面探索连翘苷的靶标蛋白,其次运用分子对接研究连翘苷与PDE3B相互作用。DARTS/SDS-PAGE结果显示:电泳条带中未能观察到明显的蛋白浓度差异条带,主要归因于DARTS技术较难找到低丰度靶蛋白,经文献调研并结合网络药理学预测结果,推测PDE3B可能为连翘苷潜在减肥作用靶标。分子对接结果表明,一方面连翘苷与PDE3B的Total-Score大于米力农(milrinone,PDE3抑制剂),另一方面连翘苷与PDE3B之间有7个氢键形成,而米力农与PDE3B间无氢键形成。因此,连翘苷极有可能为PDE3B潜在抑制剂。4.连翘苷减肥作用靶标验证(PDE3B)。分别从细胞水平和分子水平展开验证。细胞水平上首先对连翘苷和米力农竞争同一靶标PDE3B进行实验验证,其次用ELISA试剂盒法对连翘苷是否能抑制靶标PDE3B,从而可提高cAMP含量进行验证;分子水平上合成PDE3B基因,构建pET-28a-PDE3B重组质粒,对PDE3B蛋白表达、复性、纯化和验证实验进行了初步探索。结果表明:细胞水平上,米力农抑制HepG2肝细胞中脂质的积累,并且连翘苷与米力农竞争同一活性位点;同时,连翘苷能够增加肝细胞中的cAMP含量。因此,连翘苷可能是PDE3B的潜在抑制剂,即PDE3B可能是连翘苷的减肥靶标。分子水平上,由于PDE3B中疏水氨基酸较多,在大肠杆菌原核表达系统中对重组质粒分别进行IPTG浓度、诱导温度以及Ca~(2+)浓度等条件考察后,结果表明其主要以包涵体形式存在,由于PDE3B蛋白变性后复性较为困难,分子水平验证实验仍在进行中。
【图文】：

技术原理

第一章综述子化合物。研究者利用 FK506 和雷帕霉素（Rapamycin）免疫抑制剂 K506 结合蛋白12（FKBP12）进行验证，经枯草杆菌蛋白酶水解后，与对照组相比，与 rapamycin或者 FK506 结合后的 FKBP12 的蛋白条带较宽，较明显，即没有被水解或水解较少，从而验证了 DARTS 技术的正确性。但研究者考虑到 rapamycin 或者 FK506 是一种可以获得的特定的、高效的药物（活性小分子化合物），且与 FKBP12 结合活性较强，所以研究者决定检测 DARTS 这一技术是否仍适用于一种更弱的抑制剂，又采用 E4与其目标蛋白 mTOR 相互作用，从其具有抗嗜热菌蛋白酶的水解实验中再一次证明了这一靶标辨识技术手段的可行性。由此 DARTS 技术在药物靶标找寻中渐渐被人们熟知起来。AB

同工酶,机制,细胞表面,动植物细胞

酶（Phosphodiesterases，PDEs）在动植物细胞和微生要作用，它与腺苷酸环化酶（Adenylate Cyclase，AC着细胞内环磷酸腺苷（CyclicAdenosine Monophospha一种环状核苷酸，当外来信号刺激细胞表面并经跨膜传信号分子与细胞表面的受体结合形成复合体，从而进，被激活的 Gs 蛋白再进一步激活细胞膜上的 AC，AC 合形成 cAMP。cAMP 是细胞内的第二信使，它能够aseA，PKA，cAMP 依赖性蛋白激酶），使相应的靶细相关细胞反应的作用。发挥作用后的 cAMP 会进一步被Adenosine-5’-Monophosphate，5’-AMP）而失活[62]，从的生化作用。与此同时，，PDEs 也能够调节细胞中第二nosine Monophosphate，cGMP）的浓度（具体过程见图
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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