基于玄府理论应用补肺清瘀法复方对硬皮病的作用和机制研究

发布时间：2020-05-15 15:25

【摘要】：背景:硬皮病(scleroderma)是一种在病理上以纤维化为主要特征的特殊类型的结缔组织病,在临床上它的主要特点是局灶性或弥漫性皮肤增厚,轻者病变范围较为局限,重者可累及多系统、多脏器纤维化,与自身免疫、纤维化和血管病变等密切相关。目前没有明确有效的治疗方案。经前期观察,基于中医玄府理论、以补肺清瘀为主要治法而创制的补肺清瘀颗粒有一定的临床疗效,对于其现代药效物质基础及主要作用机制尚未完全阐明。研究目的:基于中医玄府理论,以补肺清瘀为主要治法,分析研究补肺清瘀颗粒的物质基础;观察补肺清瘀颗粒对硬皮病皮肤硬化的影响;应用高通量测序技术及生物信息学分析探索补肺清瘀颗粒治疗硬皮病潜在的靶基因和相关蛋白,探讨补肺清瘀颗粒治疗硬皮病的作用机理,为网络药理学提供新的科学证据。研究方法:1)运用超高效液相色谱-四极飞行时间质谱联用技术(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometr,UHPLC-Q-TOF/MS)进行补肺清瘀颗粒的物质基础研究。制备供试品与标准品后,确定并选取合适的液相色谱、质谱条件,采用UHPLC-Q-TOF/MS对该补肺清瘀颗粒复方中的代表性成分进行定性及定量分析。2)将小鼠随机分组,正常组、BLM模型组、BLM+补肺清瘀颗粒剂量组,采用给小鼠背部皮肤连续皮下注射博来霉素溶液4周复制硬皮病模型,每日灌服中药28天后,分别观察补肺清瘀颗粒对正常组、模型组和补肺清瘀颗粒组小鼠的不同治疗效果,评估其小鼠的整体健康情况并计算各脏器指数,另外,取皮肤组织对其进行组织病理学分析,用碱水解法定量测定羟脯胺酸含量、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法测定趋化因子(C-X-C基序)配体2(chemokine(C-X-C motif)ligand 2,Cxc12)含量、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)测定α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA),综合观察并评估补肺清瘀颗粒对硬皮病小鼠动物模型改善皮肤硬化的作用。3)分别取正常组、模型组和补肺清瘀颗粒组小鼠皮肤组织用Trizol法提取总RNA,RNA样本质检合格后富集mRNA,继而进行mRNA文库构建并在Hiseq X Ten(Illumina)平台上测序,随后进行数据分析,主要包括:测序原始数据质量评估及质控,RNAseq测序评估,基因表达量统计,差异表达基因筛选,差异表达基因韦恩图,差异表达基因可视化分析(火山图),蛋白互做网络分析,差异基因热图,Unigene注释(GO注释、KEGG注释),差异基因GO富集分析,差异基因KEGG富集分析。采用条件为log2 Fold Change|1,p-value0.05并且至少有一组平均TPM值≥5筛选出差异基因,并选择三个预测的靶基因用Quantitative real-time PCR进行验证,然后,通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析差异基因,并筛选出相应的信号通路,用Quantitative real-time PCR验证信号通路上相应基因,此外,通过免疫印迹法验证相关蛋白以综合探讨补肺清瘀颗粒对博来霉素诱导小鼠硬皮病模型改善皮肤硬化的分子机制。研究结果:1)补肺清瘀颗粒中皂苷类成分主要来自黄芪、党参、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸类成分主要来自丹皮、当归;丹参醌酮类成分主要来源于丹参;木脂素类成分在五味子中含量最高。2)与正常组比较,模型组小鼠虽然在不同时间点表现不完全相同,但总体趋势显示出精神萎靡,食量减少,蜷缩少动,体型减小,注射部位周围毛发停止增长,皮肤变硬且厚,弹性差;脾指数显著增加;羟脯胺酸含量明显升高;病理上模型组出现了胶原纤维明显增粗、数量增多、排列紧密、胶原间隙变窄、均质化等改变以致真皮层明显增厚,毛囊明显减少,脂肪组织层变薄、消失,并伴有炎症细胞浸润的现象;Cxc12水平明显升高;血管平滑肌阳性细胞数量增加。相较于模型组,补肺清瘀颗粒组小鼠精神尚可,取食、活动较多,皮肤硬化程度较轻;脾指数显著减小;羟脯胺酸含量显著降低;病理上看到胶原增生减少,真皮层厚度明显减少,脂肪层变厚;Cxcl2水平明显降低;血管平滑肌阳性细胞数量减少。3)通过转录组学分析,筛选出差异基因,用Quantitative real-time PCR对靶基因进行验证,其中突触体相关蛋白25(synaptosome associated protein 25,Snap25)和真核翻译起始因子3,亚基J2(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J2,Eif3j2)的表达倍数变化趋势与转录组分析数据一致,从一定程度上说明转录组学数据是可靠性。通过KEGG通路分析筛选出信号通路,发现Notch信号通路是位列前五的富集显著差异基因的通路,此外,在转录水平和蛋白水平上分别验证了Notch-1和Jagged-2,我们进一步发现补肺清瘀颗粒可以显著降低Notch-1和Jagged-2的mRNA和蛋白质表达水平。研究结论:补肺清瘀颗粒中代表性的化学成分主要有四大类,皂苷类成分主要来自黄芪、党参、桃仁、桔梗、凌霄花;酚酸类成分主要来自丹皮、当归;丹参醌酮类成分主要来源于丹参;木脂素类成分在五味子中含量最高。补肺清瘀颗粒对博来霉素诱导的SSc小鼠模型有保护作用,还可以预防脾肿大的发生并对免疫系统起到保护作用。而且,补肺清瘀颗粒在组织病理学和羟脯胺酸含量上都显示出阻止皮肤硬化发展的趋势,这机制部分可能是通过部分影响Cxcl2或中性粒细胞的参与、血管相关以及Notch信号通路等方面实现的。
【图文】：

模式图,模式,离子流,正离子

邋ｍｉｎ逡逑图３．１－１补肺清瘀颗粒中代表性化合物标准品的提取离子流图（Ａ为正离子模式，Ｂ为负逡逑离子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氢丹参酮Ｉ邋；邋５、隐丹参酮；逡逑６、五味子甲素；７、丹参酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹参素；１０、毛蕊花糖苷；１１、阿逡逑魏酸；１２、党参炔苷；１３、}P梗皂苷Ｄ；邋１４、黄芪甲苷。逡逑

模式图,离子流,正离子,水溶液

邋ｍｉｎ逡逑３．１－２补肺清瘀颗粒水溶液中代表性化合物的提取离子流图（Ａ为正离子模式，Ｂ为子模式）。１、苦杏仁苷；２、丹皮酚；３、五味子醇甲；４、二氢丹参酮Ｉ邋；邋５、隐丹参酮；逡逑五味子甲素；７、丹参酮ＩＩＡ；邋８、五味子乙素；９、丹参素；１０、毛蕊花糖苷；１１、魏酸；１２、党参炔苷；１３、桔梗皂苷Ｄ；邋１４、黄芪甲苷。逡逑利用ＴＯＦ／ＭＳ中准分子离子峰的精确质量数与文献数据进行对比定性，，结果如１－２所示；补肺清瘀颗粒水溶液进样后，提取出的１４个标准物质的色谱峰如图３．１－２，定量结果如表３．１－３所示。逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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