人参皂甙Rg1对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡的保护作用

发布时间：2020-05-16 01:42

【摘要】：脓毒症导致的急性肺损伤(ALI)/呼吸窘迫综合征(ARDS)在重症监护病房较为常见,病死率高。目前研究认为,肺上皮细胞的凋亡在ALI/ARDS的发病过程中起到重要作用。因此,探究肺上皮细胞发生凋亡的分子机制,寻求有效的干预靶点,对于ALI/ARDS的治疗具有重要的意义。最近研究发现,细胞自噬现象,作为细胞的一种自我保护反应,适当的自噬有助于维持细胞的稳态。本研究中,我们发现人参皂甙Rg1能够通过增强细胞自噬反应,来抑制LPS诱导的肺上皮细胞的凋亡。为进一步探明ALI/ARDS发生过程中,细胞自噬参与肺上皮细胞凋亡发生的分子机制,寻求抑制肺上皮细胞凋亡的有效靶点,本研究将针对上述问题展开,主要分为三个部分:第一部分:小鼠内毒素致肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型的建立目的:建立LPS诱导的ALI/ARDS小鼠模型。方法:小鼠麻醉后,采用LPS气管滴入法建立ALI/ARDS模型,在造模24小时后,采用肺功能分析系统检测气道呼吸阻力。采用RT-PCR、Western Blot等技术,检测小鼠肺组织中Caspase-3的表达情况。通过组织病理切片观察肺组织损伤情况,确认ALI/ARDS模型的成功建立。结果:LPS气道滴入可以导致小鼠急性肺损伤,造模24h后,小鼠出现呼吸急促等现象。小鼠肺功能分析系统检测显示,小鼠气道呼吸阻力明显上升;模型小鼠肺组织切片病理HE染色显示,肺组织结构炎性细胞浸润明显,微血管充血,肺间质出血水肿,肺泡结构模糊,肺泡腔大范围消失。在ALI/ARDS模型小鼠肺组织中,Caspase-3的表达在损伤24小时后较对照组明显升高,提示造模后存在肺上皮细胞的凋亡。结论:采用LPS滴注方法能够成功建立ALI/ARDS小鼠模型第二部分:细胞自噬参与LPS介导的肺上皮细胞凋亡的分子机制研究目的:阐明细胞自噬参与LPS导致的肺上皮细胞的凋亡的分子机制方法:采用LPS处理肺上皮细胞,并通过CCK8、Western blot、流式细胞仪、免疫荧光等技术,检测LPS刺激肺上皮细胞后,自噬和凋亡的变化趋势。其次,采用化学小分子抑制剂,检测调控细胞自噬对凋亡的影响,并检测细胞自噬的改变对Nrf2表达和NF-?b信号通路关键蛋白p-p65表达的影响。动物实验部分LPS肺损伤造模后,采用Western blot等技术,验证LPS刺激对肺上皮细胞自噬和凋亡的变化及Nrf2和p-p65蛋白表达的影响。结果:LPS刺激肺上皮细胞后,随着LPS浓度的增加,肺上皮细胞的凋亡也随之增加,肺上皮细胞的自噬升高。在特定LPS浓度刺激下,随着LPS作用时间的延长,肺上皮细胞的凋亡逐渐增加,而自噬先增加后降低。特定LPS浓度刺激下,在特定时间段,通过3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬可增加LPS诱导的肺上皮细胞凋亡;相反,通过雷帕霉素激活自噬可以明显减少LPS诱导的肺上皮细胞凋亡。提示细胞自噬能够调控LPS介导的肺上皮细胞的凋亡;即抑制自噬,凋亡增加;提高自噬,凋亡下降。在特定浓度LPS刺激下,随着作用时间的延长,肺上皮细胞的自噬水平先升高后下降,保护性分子Nrf2的表达也是先升高后下降,提示Nrf2在LPS介导的细胞凋亡过程中可能发挥了重要的作用。靶向抑制Nrf2能够增强p-p65的水平,导致肺上皮细胞凋亡增加,而对细胞自噬水平无明显影响。结论:LPS导致的肺上皮细胞的凋亡具有浓度和时间依赖性。在ALI/ARDS发生过程中,细胞自噬的增强,能够促进Nrf2蛋白的表达,导致炎症通路NF-?b信号通路受阻,进而抑制肺上皮细胞的凋亡,并抑制ALI/ARDS的发生发展。第三部分:人参皂甙Rg1对LPS导致的肺损伤的保护作用机制研究目的:阐明人参皂甙Rg1对LPS导致的肺损伤的保护作用机制方法:运用Western blot、流式细胞等技术,检测人参皂甙Rg1作用肺上皮细胞后细胞凋亡情况,以及相关蛋白的表达情况。通过组织结构染色,检测Rg1处理ALI/ARDA小鼠模型后,肺组织结构的变化情况。通过免疫组化方法检测相关蛋白在模型小鼠肺组织的表达情况。结果:人参皂苷Rg1能够增强肺上皮细胞的自噬水平,促进Nrf2的表达,并抑制炎性分子p-p65的表达,进而减少LPS导致的肺上皮细胞凋亡。同样,在ALI/ARDA小鼠模型中,人参皂苷Rg1能够增加细胞自噬,促进Nrf2的表达,并抑制炎性分子p-p65的表达,进而缓解LPS诱导的肺损伤。结论:人参皂甙Rg1通过提高肺上皮细胞的自噬,促进Nrf2的表达,抑制p65的磷酸化,从而对LPS诱导的小鼠急性肺损伤起到保护作用。
【图文】：

小鼠及正常小鼠肺功能相关参数正常组 力（Ri） 13.22±2.54 力（Re） 8.32±1.76 （Cldyn） 0.0191±0.0022 blot，q-PCR 来检测 caspase-3 显示，，与正常小鼠相比，在 LPSse 表达显著升高。同样，采用 q-PCR S 造模小鼠的肺组织中，Caspase 3 的 m水平相一致，提示 LPS 诱导肺损伤能

术检测模型小鼠肺组织中凋亡相关蛋白 Caspase 3 的小鼠肺组织结构变化情况片染色结果显示，LPS 造模组小鼠肺组淋巴细胞等炎症细胞浸润，肺泡结构发。而对照组肺泡结构完好，肺泡腔清晰），提示 LPS 气管滴注能够诱导 ALI/A
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2665949