药用大黄成分分析及结合型蒽醌生物转化研究

发布时间：2020-05-16 13:02

【摘要】：大黄是传统中药材品种,主产甘肃、青海、陕西、西藏等地。陕西省镇巴县是全国最大的药用大黄种植基地,但在质量标准、品质评价方面研究较少。论文系统分析了镇巴药用大黄药材的主要成分。发现了可降解大黄结合型蒽醌类化合物菌株,进一步优化了生物转化工艺参数,为游离型蒽醌单体药物的富集、制备提供了绿色工艺。分离纯化了参与生物转化的糖苷酶并研究了酶的基本特性。论文主要实验及结果如下:(1)苯酚-硫酸比色法测定镇巴药用大黄多糖含量为7.04%,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量为0.35%;根据国家标准GB 5009.4-2016测得灰分含量为3.78%;电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)测得重金属铅、镉、砷含量分别为1.94、0.56、1.76mg/kg;总蒽醌与游离型蒽醌含量分别为1.79%、1.07%,重金属及主要成分指标均符合《2015版中国药典》限量要求。(2)采用制备型高效液相色谱纯化了主要的游离型和结合型蒽醌化合物。制备得到5个游离型蒽醌单体:芦荟大黄素(99.26%)、大黄酸(98.47%)、大黄素(98.65%)、大黄酚(99.75%)、大黄素甲醚(92.31%);制备得到2个结合型蒽醌,通过与标准品比对,分别为:大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(97.65%)和大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷(98.32%)。(3)在自然环境下发现了能够在大黄药材上生长的菌株,采用平板画线法将生长旺盛的优势菌株纯化培养得到3株纯种菌株。通过形态学观察与ITS序列分析将3种菌株鉴定为:棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株、白地霉(Galactomyces)菌株、黄曲霉(Aspergillus flavus)菌株。初步转化试验结果显示3种菌株都具有将结合型蒽醌定向转化为游离型蒽醌的能力,其中黄曲霉菌株转化能力最强,转化率可达到60%以上。(4)利用黄曲霉菌株进行生物转化研究。以游离型蒽醌转化率(游离型蒽醌增加量/总游离型蒽醌量)为指标,考察转化时间、转化温度、接种量等因素对转化的影响。在单因素实验的基础上,采用响应面实验优化了转化工艺参数。结果表明:最佳转化工艺为转化时间5d,转化温度29.3℃,接种量8.4%,在此条件下,游离型蒽醌的平均转化率达73.2%。(5)通过葡聚糖凝胶柱层析分离纯化得到降解结合型蒽醌的糖苷酶,SDS-聚丙烯酰胺凝胶法测得酶分子量大小约为68kDa,并对酶的性质进行研究,确定酶反应的最适pH值为7.0,最适温度为35.0℃。体外酶催化大黄药材与大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷验证实验,表明该酶能够水解切除结合型蒽醌糖链生成游离型蒽醌。进一步证明了黄曲霉菌株是通过分泌糖苷酶水解糖侧链实现大黄结合型蒽醌向游离型蒽醌生成转化。
【图文】：

示意图,技术路线,示意图,绿色环保

型蒽醌转化为游离型蒽醌，，为游离型蒽醌化合物工业生产提供绿色环保的新方法。1.6.2 技术路线图1-9 技术路线示意图Fig.1-9 Technical route diagram

相图,标液,相图,大黄素甲醚

大黄中 5 种游离型蒽醌芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚混合标准品高效液相色谱图如图 2-4。图2-4 大黄游离型蒽醌混标液相图Fig.2-4Liquid phase diagram of Free Anthraquinone mixed standard in rhubarb
【学位授予单位】：陕西理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1

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