【摘要】：目的:以中医药理论为指导,在功效、证候背景下,通过传统中医药文献挖掘与现代药理、毒理学研究相结合的手段,在柴胡具有疏肝解郁功效和抗肝纤维化作用的基础上,建立适宜于中药病证背景下评价活性的肝郁脾虚型肝纤维化大鼠模型,运用体内、外研究手段在整体、细胞水平上开展柴胡不同样品的药效活性研究,明确柴胡对肝郁脾虚行肝纤维化的药效作用并探讨其初步药效机制,进行药效伴随毒副作用研究,揭示其受累靶器官和毒副作用特点,验证不同样品对病证模型的活性作用,为明确柴胡药效、毒性物质基础进行证候背景下的“效—毒”关联评价,为肝纤维化的中医治疗提供新的用药依据和策略。方法:通过给予注射猪血清诱导,外加不同酒精浓度及高脂低蛋白饲料喂养,多因素构建适宜肝郁脾虚证评价的肝纤维化动物模型;优化并建立肝郁脾虚型肝纤维化大鼠模型,实验期间观察大鼠一般情况,并使用中医肝郁脾虚证证候积分进行评价,观察柴胡水提物和柴胡总皂苷对模型大鼠的抑制作用;检测血清中ALT、AST、LN、HA、PC-III、IV-C、TGF-β1、BUN、Cr指标的变化,并进行肝组织马松染色分析肝脏纤维化病变程度,明确柴胡不同组分对模型大鼠的伴随毒性;体外通过培养HSC-T6细胞和L-02细胞,运用MTT实验、观察细胞形态学变化,考察柴胡不同组分对HSC-T6细胞和L-02细胞的影响,并检测细胞上清液LDH、GSH和GSH-Px的含量来进一步探究柴胡不同组分体外产生“效—毒”的作用剂量,明晰安全剂量范围。结果:在造模3周后,各模型组的大鼠均达到明显肝纤维化损伤程度,且大鼠主证、次证均符合肝郁脾虚证的证候表现。与正常对照组比较,血清ALT、AST、TGF-β1水平显著升高,肝纤维化四项LN、HA、PC-III、IV-C的水平均明显升高;病理切片可见肝细胞纤维隔形成,达到明显肝纤维化程度;且动物无死亡现象。成模后连续给予0.90~3.60 g·kg~(-1)柴胡水提物和7.04~13.90mg·kg~(-1)柴胡总皂苷的可改善大鼠饮食、饮水和活动情况,明显降低肝纤维化大鼠血中HA、LN、IV-C、PCIII等指标含量和肝脏系数,病理组织学改变减轻。但药物高剂量组血中ALT、AST、BUN、Cr水平升高。体外给予肝星状HSC-T6细胞和肝正常L-02细胞不同剂量的柴胡水提物和柴胡总皂苷,柴胡水提物对HSC-T6细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为6.23mg·mL~(-1),对L-02细胞的TC_(50)为10.70mg·mL~(-1);柴胡总皂苷对HSC-T6细胞的IC50为3.52mg·mL~(-1),对L-02细胞的TC_(50)为6.68mg·mL~(-1)。检测给药后细胞的上清,给药24h后发现LDH活性随给药浓度的上升而升高,与剂量呈现正相关;而细胞上清液中GSH、GSH-Px的活性均随浓度的上升而下降,与剂量呈现负相关。结论:经过改良高脂低蛋白饲料及酒精刺激强度后,能够成功建立肝纤维化(肝郁脾虚证)大鼠模型,该模型证候与临床病证吻合度较高;柴胡水提物、柴胡总皂苷均对肝郁脾虚型纤维化大鼠具有显著的治疗作用,可减轻病证程度,且量效关系良好,同时3.60 g·kg~(-1)柴胡水提物和13.90mg·kg~(-1)的柴胡总皂苷会产生一定的肝脏、肾脏的伴随毒副作用。HSC-T6细胞和L-02细胞随柴胡水提物剂量升高抑制率升高,呈现正相关,提示柴胡水提物“效—毒”剂量安全窗范围为6.23 mg·mL~(-1)~10.70 mg·mL~(-1),治疗指数(TI)为1.72;HSC-T6细胞和L-02细胞随柴胡总皂苷剂量升高抑制率升高,呈现正相关,提示柴胡总皂苷“效—毒”剂量安全窗范围为3.52 mg·mL~(-1)~6.68 mg·mL~(-1),治疗指数(TI)为1.90。给药后的HSC-T6和L-02细胞上清中均检测到GSH、GSH-Px活力下降,并且伴随LDH的浓度升高,提示柴胡水提物和柴胡总皂苷抑制HSC-T6和L-02细胞生长与影响细胞中自由基有关。
【图文】：
改良高脂和酒精刺激强度对大鼠肝纤维化模型体重的影响
图 2 改良高脂和酒精刺激强度对大鼠肝纤维化模型体重变化的影响3.1.2 日食量及日水量的变化肝郁脾虚证主要表现为肝脏疏泄失调、脾胃健运不畅，因而在造模过程中，
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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