去甲斑蝥素抑制三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭转移的功能和机制研究

发布时间：2020-05-17 11:29

【摘要】：第一部分去甲斑蝥素调控β-catenin/miR-301a/ZBTB4信号通路抑制三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭的研究目的:研究显示,miR-301a可促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但miR-301a在三阴性乳腺癌中的功能及其机制尚不明确。本课题旨在研究:miR-301a对三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭的作用;miR-301a的下游靶基因调控机制;去甲斑蝥素通过调控miR-301a对三阴性乳腺癌侵袭转移的影响。方法:利用生物信息学技术分析miR-301a的表达水平;通过定量PCR验证miR-301a在乳腺癌组织中的表达水平;使用transwell实验研究miR-301a对三阴性乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响;通过免疫印迹、免疫组织化学和免疫荧光技术检测相关蛋白表达水平;利用双荧光素酶报告基因验证miR-301a下游靶基因;使用BALB/c标准小鼠建立肺转移模型进行动物实验。结果:本课题实验结果显示,通过分析癌症基因组图谱的高通量测序数据,miR-301a在三阴性乳腺癌中异常高表达。miR-301a类似物可促进三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭,而miR-301a抑制物可削弱三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。通过双荧光素酶报告基因确定ZBTB4为miR-301a的下游靶基因,且过表达ZBTB4可减弱miR-301a对三阴性乳腺癌的作用。敲低β-catenin后miR-301a表达水平降低,ZBTB4表达水平升高,但过表达miR-301a和ZBTB4对β-catenin的表达水平没有影响。此外,去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)通过Wnt/β-catenin信号通路抑制miR-301a,上调ZBTB4表达水平,抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和侵袭,并减少小鼠肺转移灶的数量。结论:本课题研究表明,miR-301a通过靶向ZBTB4在三阴性乳腺癌中发挥致癌作用;去甲斑蝥素可通过Wnt/β-catenin信号通路调控miR-301a,抑制三阴性乳腺癌的侵袭转移。第二部分去甲斑蝥素调控Akt和ERK信号通路诱导三阴性乳腺癌细胞衰老和周期停滞的研究目的:Akt和ERK信号通路的激活与乳腺癌的进展密切相关,抑制Akt或ERK信号可导致细胞衰老。然而,细胞衰老过程中Akt和ERK信号通路间的相互作用以及如何同时抑制三阴性乳腺癌中的Akt和ERK信号传导尚未阐明。本课题旨在验证去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)对细胞周期和细胞衰老的影响,并探讨其在三阴性乳腺癌中与Akt和ERK信号通路的关系。方法:使用CCK-8试剂盒检测细胞活力和细胞增殖率;通过流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡;利用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老;通过免疫印迹和免疫组织化学技术测量蛋白水平;使用NF-κB报告基因检测荧光素酶活性;通过裸鼠皮下成瘤进行动物实验。结果:本课题实验结果显示,NCTD可在体外有效诱导三阴性乳腺癌细胞周期停滞和细胞衰老,同时伴随磷酸化Akt和ERK1/2的下降以及p21和p16的上升;联合使用信号通路抑制剂LY294002和U0126可获得类似NCTD的效果;NCTD通过下调磷酸化Akt和ERK1/2以及上调p21抑制小鼠体内肿瘤的生长。此外,NCTD以NF-κB非依赖的方式上调衰老相关分泌表型可溶性信号传导因子的表达水平。结论:本课题研究结果表明,NCTD主要通过同时阻断三阴性乳腺癌中Akt和ERK信号传导诱导细胞衰老和细胞周期停滞,提示NCTD可能是三阴性乳腺癌潜在的辅助治疗手段,其上调衰老相关分泌表型相关因子的机制仍需进一步研究。
【图文】：

重庆医科大学博士研究生学位论文6 *表示 p <0.05，**表示 p <0.01。 结果.1 miR-301a 在乳腺癌中的表达情况研究显示，miRNA 在恶性肿瘤中异常表达，导致下游靶基因的表达和功能以及肿瘤的发生发展。因此，课题组首先研究了 miRNA 在乳腺癌中的表达情.1.1 miR-301a 在乳腺癌中异常高表达课题组利用肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的测序数析了 miRNA 在 103 例乳腺癌组织及配对癌旁组织中的表达情况。结果显示iR-301a 在乳腺癌中的表达明显升高。（图 1.1.1）

miR-301aexpressionlevelnon-TNBC TNBC02468(n=746) (n=151)**图 1.1.2 miR-301a 在三阴性乳腺癌和非三阴性乳腺癌中的表达情况e 1.1.2 Expression of miR-301a in triple-negative breast cancer and non-triple nbreast cancermiR-301a 在乳腺癌临床样本中的表达情况进一步验证 miR-301a 的表达情况，，课题组通过定量 PCR 检测了 m医科大学附属第一医院乳腺癌临床样本中的表达水平。结果显示，m癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，且 miR-301a 在 TNBC 组织明显高于非 TNBC 组织。（图 1.1.3）
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2668472