酚酸类化合物黄芩素和迷迭香酸的甲基化代谢研究

发布时间：2020-05-18 09:42

【摘要】：第一部分黄芩素的体外代谢研究目的:研究黄芩中的主要活性成分黄芩素在人体中的主要代谢途径,明确其代谢产物的结构类型,阐明参与其代谢的主要代谢酶及相关的主要单酶亚型,代谢动力学特征;黄芩素代谢的种属间差异;评价黄芩素和代谢产物的药理活性,为黄芩素的临床合理应用提供一定的参考。方法:(1)体外代谢实验:利用体外人的肝S9,HLC,HLM,混合肠微粒体,肠S9,14种UGT重组单酶亚型及常用的实验动物S9(食蟹猴Cy LS9,大鼠Rt LS9,小鼠Ms LS9,豚鼠GLS9,比格犬DLS9,兔Ra LS9,猪PLS9)对黄芩素的代谢途径,代谢酶归属,动力学模型,表观动力学参数以及代谢的种属间差异进行详细研究;(2)利用生物合成方法制备相关代谢产物,并利用植物化学和相关波谱学方法对其代谢产物进行分离纯化并鉴定其结构,明确其代谢位点;(3)利用LPS刺激RAW264.7细胞释放NO构建炎症模型,评价原形药物和其代谢产物的抗炎活性。结果:黄芩素在人肝S9中经COMT催化生成6-O-甲基黄芩素(M-1:木蝴蝶素A),S-COMT主要介导了黄芩素的甲基化代谢,相比野生型S-COMT其108m位点突变株S-COMT(108m)表现出较低的催化活力;黄芩素的甲基化代谢在HLS9,HLC,HLM,HIS9及S-COMT中的代谢特征均遵循经典米氏动力学;并求得相应的表观动力学参数(Vmax,Km,Ki和CLint);黄芩素的甲基化产物(木蝴蝶素A)作为中间代谢产物可以快速的被UGTs进一步代谢生成黄芩素-6-O-甲基-7-O-葡萄糖醛酸苷结合物随尿液排出体外(M-2:千层纸素A-β-D-葡萄糖醛酸苷)。由单酶归属,化学抑制实验结果可知,此葡萄糖醛酸化代谢过程主要是UGT1As家族参与;动力学分析结果显示产物木蝴蝶素A的UGT代谢在人肝微粒体HLM,UGT1A10,1A9中遵循经典米氏动力学,而在人肠微粒体HIM,UGT1A1,1A3,1A7,1A8中表现为底物抑制动力学,并得到动力学参数(Vmax,Km,Ki和CLint);黄芩素的代谢过程的种属间差异研究表明:第二步葡萄糖醛酸化代谢过程在所有种属中均表现出很好的代谢速率,而其甲基化过程在代谢速率,亲和力上表现出明显的种属间差异,动力学研究显示猴中甲基化代谢清除过程与人最为接近;体外抗炎活性研究表明黄芩素中间代谢产物M-1(木蝴蝶素A)仍表现较好的抗炎活性,IC50为28μΜ,而终代谢产物千层纸素A-β-D-葡萄糖醛酸苷没有抗炎活性。结论:本文首次探究了黄芩素在人体中主要代谢产物千层纸素A-β-D-葡萄糖醛酸苷的代谢形成过程:即先甲基化代谢随后葡萄糖醛酸化的两步代谢;S-COMT和UGT1As主导了这两步代谢过程。研究发现甲基化代谢过程缓慢,是整个反应过程的限速步骤,同时黄芩素的甲基化过程表现出明显的种属间差异,其中食蟹猴的代谢动力学和代谢清除率与人的较为接近。因此,基于代谢角度食蟹猴可能更适合作为黄芩素相关药理和毒理学研究的模式动物;这些发现都为黄芩素研究中模式动物的选择提供一定的参考,同时,也为其临床合理应用和相关结构的新药开发提供宝贵的建议。第二部分迷迭香酸的体外代谢及代谢的种属差异研究目的:探究迷迭香酸的体外代谢稳定性,明确其主要的代谢通路,代谢产物的结构类型,参与代谢的主要单酶亚型,代谢动力学特征,以及迷迭香酸代谢的种属间差异;研究迷迭香酸与多巴胺之间可能存在的药物-药物相互作用(DDI),为迷迭香酸的药物开发和临床合理应用提供一定的参考。方法:(1)体外实验:利用体外人肝S9,HLC及常用的实验动物肝S9(食蟹猴Cy LS9,大鼠Rt LS9,小鼠Ms LS9,豚鼠GLS9,比格犬DLS9,兔Ra LS9,猪PLS9)对迷迭香酸的代谢途径,动力学模型,表观动力学参数和代谢的种属间差异进行详细研究;(2)利用生物合成方法制备相关代谢产物,并利用植物化学和波谱学方法进行分离纯化并鉴定结构明确其代谢位点;(3)利用体外孵育体系,评价迷迭香酸对多巴胺的甲基化代谢的抑制活性;进行抑制动力学分析,确定相关抑制动力学参数。结果:通过体外筛选,迷迭香酸在人体内主要进行甲基化代谢,其体外甲基化代谢的主要代谢产物为3′(M-1)和4′(M-2)位甲基化产物;迷迭香酸在人肝S9,HLC中的动力学模型均为底物抑制动力学,种属:M-1在小鼠,豚鼠,猪,兔里的动力学遵循经典米氏动力学,在食蟹猴,狗,大鼠里的动力学遵循底物抑制动力学;M-2在小鼠,豚鼠,兔里遵循经典米氏动力学,在猪,食蟹猴,狗,大鼠里遵循底物抑制动力学,并得到其相应的动力学参数(Vmax,Km,Ki和CLint);迷迭香酸对多巴胺的甲基化代谢表现出较强的抑制作用,其抑制形式为竞争性抑制,Ki为0.35μM。结论:本实验首次对迷迭香酸的代谢稳定性进行了系统筛选,确定了甲基化为其主要的代谢清除路径,鉴定了甲基化代谢的代谢产物结构和参与的相关单酶亚型,并详细描绘了其代谢动力学模型;迷迭香酸的甲基化代谢存在较大的种属差异。基于代谢的角度大鼠可能更适用于作为迷迭香酸相关药理学,毒理学研究的模式动物;迷迭香酸对多巴胺的甲基化代谢存在较强的抑制,这为以后迷迭香酸的相关药物的开发和临床合理使用提供一定的参考。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2669534