p62在β-七叶皂苷钠诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-18 14:27

【摘要】：目的:观察药物β-七叶皂苷钠对信号适配器p62蛋白和自噬表达的影响以及p62蛋白和自噬在结直肠癌细胞对β-七叶皂苷钠化疗敏感性的作用;探讨p62蛋白影响结直肠癌细胞对β-七叶皂苷钠化疗敏感性的机制。方法:CCK8法和克隆形成实验检测β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞增殖作用的影响;Western blot检测不同浓度不同时间β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞p62的影响;PCR检测不同浓度β-七叶皂苷钠对p62 m RNA水平的影响;Western blot检测加入NAC后β-七叶皂苷钠对p62表达的影响;Western blot和流式细胞术检测β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞凋亡的影响;Western blot和细胞免疫荧光法检测β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞DNA损伤的影响;采用质粒FLAG-p62过表达和小干扰RNA干扰肿瘤细胞内p62蛋白水平后,CCK8法检测过表达和干扰p62联合β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞增殖活力的影响,流式细胞术检测过表达和干扰p62联合β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞凋亡的影响,Western blot检测过表达和干扰p62联合β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞内凋亡相关蛋白和DNA损伤修复蛋白表达的影响;裸鼠皮下成瘤实验检测干扰p62表达对结直肠癌生长及其对β-七叶皂苷钠化疗疗效的影响;使用ATM抑制剂联合β-七叶皂苷钠后,Western blot和流式细胞术检测ATM抑制后β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞凋亡的影响;Western blot检测β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞自噬的影响,CCK8和Western blot检测干扰Atg5表达联合β-七叶皂苷钠对结直肠癌细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响。结果:(1)CCK8和克隆形成实验结果显示,β-七叶皂苷钠以浓度依赖性和时间依赖性方式抑制HCT116和HCT8细胞的细胞活力和集落形成数。(2)β-七叶皂苷钠作用于结直肠癌细胞诱导细胞内ROS产生,Western blot和免疫荧光结果显示β-七叶皂苷钠以浓度依赖性和时间依赖性方式诱导DNA损伤,同时,Western blot结果显示β-七叶皂苷钠以相同方式上调p62,p62的上调发生在转录水平,并能被NAC部分消除。(3)β-七叶皂苷钠诱导的p62上调对β-七叶皂苷钠诱导的DNA损伤具有保护作用,因为使用两种si RNA干扰p62表达后明显增强β-七叶皂苷钠诱导的DNA损伤,而过表达p62减少β-七叶皂苷钠诱导的DNA损伤。(4)Western blot和流式细胞术显示β-七叶皂苷钠诱导浓度依赖性和时间依赖性的细胞凋亡;与DNA损伤结果类似,干扰p62表达增加β-七叶皂苷钠诱导的细胞增殖抑制和凋亡,过表达p62降低β-七叶皂苷钠诱导的细胞增殖抑制和凋亡。(5)通过裸鼠皮下成瘤实验发现,干扰p62表达抑制结直肠癌的生长,同时也增加其对β-七叶皂苷钠的化疗敏感性。(6)机制研究表明p62调控的DNA损伤与β-七叶皂苷钠诱导的细胞凋亡相关,Western blot和流式细胞术结果显示,干扰p62表达联合ATM抑制剂KU55933增强了β-七叶皂苷钠诱导的DNA损伤并进一步增加了β-七叶皂苷钠诱导的细胞凋亡。(7)Western blot结果发现β-七叶皂苷钠诱导细胞内自噬水平激活,干扰Atg5表达抑制细胞自噬增加β-七叶皂苷钠诱导的细胞增值抑制、DNA损伤和细胞凋亡。结论:(1)β-七叶皂苷钠诱导结直肠癌细胞细胞p62、自噬和DNA损伤以浓度依赖性和时间依赖性上调。(2)p62和自噬降低结直肠癌细胞对β-七叶皂苷钠的化疗敏感性,其分子机制涉及细胞凋亡和DNA损伤修复反应。(3)p62介导的ATM/γH2AX信号通路和β-七叶皂苷钠介导的自噬可能是β-七叶皂苷钠发挥抗肿瘤作用的潜在靶标,为临床上β-七叶皂苷钠治疗结直肠癌提供理论依据。
【图文】：

图 2. β-七叶皂苷钠诱导结直肠癌细胞凋亡。（A-B）β-七叶皂苷钠诱导细胞凋亡细胞经过不同浓度 β-七叶皂苷钠（0 60 μg/ml）作用 12 小时，，细胞凋亡数值通过式细胞仪分析，右方是细胞凋亡统计图。（C-D）β-七叶皂苷钠诱导凋亡相关蛋白上调细胞经过不同浓度 β-七叶皂苷钠（0 80 μg/ml）作用 12 小时或相同浓度 β-七叶皂

图 3. β-七叶皂苷钠诱导 p62 上调。（A）细胞经过不同浓度 β-七叶皂苷钠（0μg/ml）作用 12 小时或相同浓度 β-七叶皂苷钠（60 μg/ml）作用不同时间（3-24 小时Western blot 检测 p62 蛋白的表达。（B）p62 蛋白的量化统计图。（C）细胞经过不浓度 β-七叶皂苷钠（0 80 μg/ml）作用 12 小时，qPCR 实验检测 p62 的 mRNA 水平
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 于春丽;;β-七叶皂苷钠辅治急性特发性面神经麻痹的效果探讨[J];中国医药指南;2017年36期

2 吴锦慧;;金黄膏外敷治疗β-七叶皂苷钠所致静脉炎疗效观察[J];云南中医中药杂志;2016年07期

3 刘晓霞;张素珍;;β-七叶皂苷钠所致静脉炎的原因分析与防护[J];护理实践与研究;2012年15期

4 张欲晓;石慧珠;;β-七叶皂苷钠临床应用时的注意事项[J];中国社区医师(医学专业);2011年31期

5 上官稳;;β-七叶皂苷钠针合半夏白术天麻汤治疗梅尼埃病临床观察[J];辽宁中医药大学学报;2009年08期

6 傅承桦;尹爱良;于淑丽;贺传基;;不同年龄患者应用小剂量硫酸镁静注预防β-七叶皂苷钠所致静脉炎的临床观察[J];河北医学;2008年10期

7 郑润君;赵梁;;β-七叶皂苷钠治疗骨科术后肢体肿胀75例临床观察[J];福建医药杂志;2006年03期

8 李金英,许恒忠,于乐林;β-七叶皂苷钠在临床中的应用[J];实用医技杂志;2004年04期

9 郭晓霞;注射用β-七叶皂苷钠在临床中的应用[J];天津药学;2004年03期

10 乔昌明,葛明东;静脉滴注β-七叶皂苷钠引起皮下坏死1例[J];山东医药;2003年29期

相关会议论文 前4条

1 陶克;陈壁;胡大海;;β-七叶皂苷钠对烫伤后休克期大鼠的抗渗作用[A];全国危重烧伤患者早期复苏对策专题研讨会论文汇编[C];2005年

2 刘美;谭静川;董岩;;两种湿敷法用于β-七叶皂苷钠所致静脉炎的护理疗效比较[A];2010年中国中西医结合周围血管疾病学术交流会论文集[C];2010年

3 韦玮;曹慧琴;;β-七叶皂苷钠联合甘露醇治疗颅脑损伤后蛛网膜下隙出血效果评价[A];中国中药杂志2015/专集：基层医疗机构从业人员科技论文写作培训会议论文集[C];2016年

4 尚永健;冯六泉;孙小超;;地奥司明联合β-七叶皂苷钠治疗肛门手术后创缘水肿的临床疗效观察[A];中国肛肠病研究心得集[C];2011年

相关硕士学位论文 前2条

1 王钟;p62在β-七叶皂苷钠诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用及机制研究[D];苏州大学;2018年

2 陈东升;心肺复苏后大鼠脑组织低氧诱导因子-1α、水通道蛋白-4表达变化及β-七叶皂甙钠干预作用的研究[D];大连医科大学;2011年

本文编号：2669863