基于化学物质组和药物代谢组研究蜜煎菖蒲方防治缺血性脑卒中的配伍机制

发布时间：2020-05-19 21:11

【摘要】：蜜煎菖蒲方出自《回回药方》,由石菖蒲和番红花(西红花)组成,具有健脾化痰,活血化瘀的作用,专治半身不遂、口眼歪斜,能去本身风湿,能言善快,现代药理和临床实验数据表明蜜煎菖蒲方对中风后半身不遂、改善语言功能障碍具有良好的促进作用。本论文利用UPLC-QTOF-MS联用技术,以复方化学物质基础为切入点,对石菖蒲和番红花配伍前后原型、入血和入脑成分进行整体辨识,明确配伍的化学物质基础;以大鼠MCAO致缺血性脑卒中为模型,以LC-MS代谢组学为手段,考察配伍药效作用和对缺血性脑卒中生物标志物的调控作用和代谢途径。结合以上化学物质组和代谢组学两方面阐明其配伍规律,为中药复方配伍规律的研究提供思路和方法。本论文采用UPLC-QTOF-MS技术对蜜煎菖蒲方的化学成分进行解析,并对蜜煎菖蒲方给药后的吸收入血成分和入脑成分进行了鉴定。结合数据库自动匹配技术和二级碎片离子的方法,在蜜煎菖蒲方中共鉴定了24种原型成分,包括来自西红花的7种成分和来自石菖蒲的17种成分,其主要为挥发性成分、有机酸类和萜类成分。在灌胃分别给予正常鼠和MCAO模型鼠蜜煎菖蒲方后,在血清中,我们鉴定出存在于西红花的成分有8个,除了在药材中已存在的西红花酸、番红花Ⅰ,番红花苷K和番红花碱4个成分外,还出现了4个新的成分,分别为谷甾醇、番红花醛、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸和番红花苷G,推测可能是西红花与石菖蒲配伍之后产生了新的成分或是以代谢成分的形式入血的。与此同时,我们对其入脑成分进行了鉴定,结果显示,在正常鼠中,检测到西红花入脑成分6个,在模型鼠中检测到西红花入脑成分为7个,与西红花单味药材成分相比,只有3种成分(西红花酸、番红花苷G和番红花苷H)以原型成分入脑,另产生了7种新的成分。然后,我们发现西红花与石菖蒲配伍之后,原本在西红花单味药材脑组织中检测不到的物质会出现在配伍之后的脑组织中,主要有西红花酸、克罗西汀-甲基酯、番红花I、番红花醛和3-羟基-4-甲氧基苯甲酸5个成分,我们推测石菖蒲能够促进西红花化学成分透过血脑屏障,起到治疗脑卒中的作用。以上配伍前后化学物质基础上的解析为后续蜜煎菖蒲方的质量控制和体内代谢物分析提供了实验依据。以线栓法制备的MCAO大鼠为模型,采用UPLC-QTOF-MS技术对蜜煎菖蒲方干预缺血性卒中的作用机制进行了血清代谢组学研究。在血清中,我们结合正负离子模式共筛选了40种脑缺血潜在的血清生物标志物,通过标准品验证鉴定了11种内源性代谢物,主要包括色氨酸、泛酸、硬脂酸、苯甲酸、3-甲基吲哚、4-羟基苯甲酸-正丁酯、维达洛芬、1-肉豆蔻酰-2-羟基-sn-甘油-3-PC、猪毛菜酚、茉莉酸甲酯和异嗪吡啶,其余的还在鉴定当中。它们主要参与泛酸盐和辅酶A生物合成、氨基酰-tRNA合成、氨基酸代谢和酮体的合成与降解等代谢通路调节,差异性代谢物的PLS-DA图结果显示脑卒中大鼠给予蜜煎菖蒲方后血清代谢物较单体成分和单味药相比更趋近于假手术组,即石菖蒲和西红花配伍后能够协同调控脑卒中大鼠血清代谢标志物,使之趋近于正常组水平,从而达到协同增效的作用。为进行全面的代谢组学分析,建立了基于UPLC-QTOF-MS的脑组织代谢组学方法。经多元统计分析和潜在生物标志物的筛选,在正负离子模式下我们初步筛选了脑组织中21种差异性代谢物。通路分析结果表明,主要涉及到的通路有氨基酸代谢、糖降解、三羧酸循环等,经过含量差异统计,我们发现21个差异性代谢物经蜜煎菖蒲方干预给药后,具有向正常水平接近的趋势,从而推测蜜煎菖蒲方对脑缺血损伤的机制可能与氨基酸代谢、糖降解、三羧酸循环等通路的调节有关,并且组织的差异性代谢物PLS-DA得分图结果与血清代谢物的PLS-DA得分图趋势一致,进一步说明了西红花与石菖蒲配伍之后比单味药的治疗效果更接近于假手术组,具有协同增效的作用。综合以上化学物质基础、体内整体动物药效学和代谢组学结果,表明蜜煎菖蒲方配伍后促进了西红花苷类有效成分的入血和入脑,从而达到预防治疗缺血性脑卒中的药效作用;从代谢组学角度,是复方能够协同调控缺血性脑卒中代谢标志物,使之较单味药更趋近于正常水平,从而达到协同增效的作用。
【图文】：

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宁夏医科大学硕士学位论文前言阳还五汤也具有神经保护作用并促进脑修复的作用[7]。《回回药方》中收载的蜜煎菖蒲方由西红花和石菖蒲组成（图 1），专治半身不遂、口眼歪斜，能去本身风湿，又能言快。临床试验证明，蜜煎菖蒲方能明显的改善脑卒中患者的语言障碍和日常生活活动能力，还能够显著的降低患者血清总胆固醇和甘油三酯，，对脂质代谢紊乱具有调节作用[8]；同时，体外药理实验也证明，蜜煎菖蒲方能够保护脑缺血大鼠神经元的损伤[9]和抑制血栓的形成[10]。

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图 1-1 基于 UPLC-QTOF-MS 的蜜煎菖蒲方的化学成分解析Fig. 1-1 Chemical constituents analysis of MJCPD based on UPLC-QTOF-MS1.实验方法1.1 材料与仪器1.1.1 材料西红花苷Ⅰ(HPLC≥98%，AF8061502)、西红花苷Ⅱ(HPLC≥98%，AF7121712)、西红花酸(HPLC≥98%，PS1410601)、β-细辛醚（HPLC≥98%，AF7112004）和 α-细辛醚(HPLC≥98%，AB170305012)对照品购自成都埃法生物科技有限公司；石菖蒲和西红花饮片均购自宁夏明德中药饮片有限公司，经宁夏医科大学生药教研室董琳副教授鉴定西红花为鸢尾科植物属番红花 Crocus sativus L.的干燥柱头、石菖蒲来源于天南新科植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schoott 的干燥根茎，均符合 2015 版《中国药典》标准记载的药材来源。分析级无水乙醇、甲醇、乙腈均
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R289.1

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