松杉灵芝多糖降脂机理的研究以及磁性荧光纳米探针的合成在分离膜蛋白中的应用

发布时间：2020-05-19 21:16

【摘要】：高血脂症是动脉粥状硬化的首要危险因素,目前临床上用于降脂的西药虽然疗效确切,但毒副作用较大,不宜长期服用。因此,寻找开发无毒而有效的降脂药品具有重大的意义。本研究分为两个部分,我们首先探究了松杉灵芝多糖诱导人肝癌细胞HepG2细胞中胆固醇合成抑制的分子机制。在筛选多糖在细胞膜上受体过程,并未在目前熟知的的多糖结合膜蛋白中筛选到相应受体。基于多糖细胞膜上受体研究方法的局限,我们开展了第二部分的研究工作构建了Fe_3O_4@SiO_2/CdTe/CdS-SBT双功能的磁性荧光纳米探针,并成功地验证了其可操作性一、松杉灵芝多糖诱导人肝癌细胞中胆固醇合成抑制的分子机制研究1.前期研究我们发现,SBT能够诱导肝细胞内胆固醇合成限速酶HMGCoA表达的降低。为了进一步研究其药理机制,我们用不同浓度的SBT诱导HepG2细胞48h后,测定了胆固醇生理合成途径中的多种蛋白的表达情况。结果显示:随着SBT浓度的增高,SREBP2蛋白的表达量逐渐升高,而S2P蛋白的表达量呈逐步减少。选用固定浓度诱导HepG2细胞(0,3,6,12,24小时)后,发现随着诱导时间的增加,SREBP2蛋白的表达量有微小的下降趋势;SCAP蛋白的表达量先升高后降低;S2P蛋白的表达量先下降后上升;Insig-1蛋白的表达量呈下降的趋势。虽然各个蛋白的表达量都存在一定的变化,但由于其变化量较小。因此,我们推断出SBT对肝细胞内胆固醇调节的生理合成途径与SREBP-SCAP通路不相关。2.为了进一步探究多糖SBT抑制肝细胞内胆固醇合成的分子机制。进行了SBT多糖在细胞膜上结合蛋白的筛选。应用细胞免疫荧光法,以肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L02为研究对象,结果显示肝细胞表面Dectin-1受体蛋白的表达量极低,而Dectin-2蛋白虽有表达,但并不是SBT在肝细胞膜上的受体蛋白。二.双功能磁性荧光纳米探针的构建及在分离膜蛋白中的应用1.首先采用共沉淀法合成了Fe_3O_4磁性纳米粒子,并在其外修饰了一层SiO_2,得到了Fe_3O_4@SiO_2磁性纳米粒子。借助丁二酸酐的开环反应,对其表面进行硅羟基修饰,得到了Fe_3O_4@SiO_2-SA磁性纳米粒子。表征结果表明:其具有很好的磁分离能力。其次利用一锅法合成了水溶性的CdTeQDs,并用硫脲在CdTeQDs表面包裹了一层CdS,合成核壳型CdTe/CdS荧光量子点,并使其表面带有大量的氨基。经表征显示:其荧光强度高,且稳定性好。通过酰胺化反应,进一步合成了磁性荧光复合物Fe_3O_4@SiO_2/CdTe/CdS。表征结果显示,Fe_3O_4@SiO_2/CdTe/CdS复合物具有较好的磁性和较强的荧光强度,在生物医学领域具有潜在的应用价值。2.SBT溶于水后,其还原末端暴露,能够与氨基进行缩合反应。通过缩合反应,将CdTe/CdS、Fe_3O_4@SiO_2-SA与SBT偶联,构建了Fe_3O_4@SiO_2/CdTe/CdS-SBT磁性荧光纳米探针。并用于HepG2细胞表面的SBT的膜蛋白受体的检测,在细胞表面清晰地看到了磁性荧光纳米探针的分布,识别了HepG2细胞表面的SBT受体蛋白的存在。通过超声裂解提取细胞膜蛋白的方法,用磁分离的方法快速富集了磁性荧光纳米探针特异性结合的SBT受体蛋白。本研究为今后膜蛋白的研究提供了新的思路与方法。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285;O657.3

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本文编号：2671498