基于斑马鱼毛细胞损伤模型的抗耳毒活性组分的研究

发布时间：2020-05-20 09:52

【摘要】：听力功能障碍是由于各种原因引起双耳不同程度损伤而达不到正常功能水平的感觉功能障碍。若其不能被及时发现并进行良好的干预将严重影响患者的言语、认知及情感的发育,进而影响其身心健康和生活质量,同时也会加重社会经济负担。氨基糖苷类抗生素是用于靶向革兰阴性菌的一类重要的抗感染剂,作为一类广谱抗菌且无明显过敏性的抗生素在临床一直备受青睐,但其应用却因巨大的耳毒性和肾毒性而受到很大限制。即便如此,在治疗多耐药性菌群感染时,庆大霉素等氨基糖苷类抗生素发挥着极其重要的作用。由于其价廉易得、抗菌谱广等特点,临床应用也相对广泛,引发的听力障碍在治疗人群占有较高的比例。同时,临床上尚无疗效良好的治疗耳聋药物。因此,建立一种药源性耳聋模型,进一步寻找抗耳聋药物达到克服其毒性而不影响其药效的方法,并进一步阐明耳聋机制和药物抗耳聋机制显得尤为重要。以往比较常见的药物耳毒性评级机制是建立在药物对豚鼠或者大鼠的内耳毛细胞损伤基础之上的。由于这两种模式动物在对药物的毒性安全进行考察时会存在较大局限性,斑马鱼作为新型模式动物也逐渐吸引了越来越多的科研工作者。许多传统中药及相关方剂被证明对耳聋具有一定的疗效,而对具体到某一种中药的抗耳聋活性组分却是知之甚少。此外,药用植物内生真菌素以代谢产物丰富、活性多样化而成为近年天然药物研究的热点之一,但其用于抗耳毒性活性成分筛选的研究甚少。因此,本研究以庆大霉素为模型药物,旨在建立一种稳定的药源性斑马鱼毛细胞损伤模型,通过对多种中药材粗提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三相萃取物和水相,以及从两株华南毛蕨内生真菌CYC6和CYC18发酵液中分离纯化的部分次级代谢产物进行筛选,快速寻找具有抗耳毒活性组分。主要研究内容包括:(1)利用已知具有明确耳毒性的庆大霉素建立药源性斑马鱼毛细胞损伤模型,并将一侧斑马鱼神经丘(SO1、SO2、O1、OC1)毛细胞形态及其数量的变化作为检测指标。将斑马鱼分别置于100、50、25及10μmol/L庆大霉素溶液中孵育8、6和4 h发现,10μmol/L庆大霉素中孵育6 h可以使毛细胞损伤程度达到一半,建立达到类似IC50效果的毛细胞损伤模型。同时通过不同浓度(0.5%、0.2%)DMSO作用不同时间(6、4及2 h)发现,DMSO对斑马鱼具有一定的损伤作用;0.2%DMSO对斑马鱼毛细胞损伤很小,可作为合适的药物助溶剂。(2)利用所建立的模型,首次将具有抗耳毒性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)和依达拉奉单独作为阳性药物,揭示出该药源性斑马鱼毛细胞损伤模型的稳定性,以及后期用于大规模筛选时的可行性。研究发现,200μmol/L NAC对庆大霉素介导的斑马鱼毛细胞损伤具有拮抗作用;250μmol/L依达拉奉也对其具有保护作用。(3)多种中药提取物中抗耳毒活性组分的筛选。利用已建立的斑马鱼毛细胞损伤模型研究不同浓度(20、100和500μg/mL)香附、蝉蜕、地龙、苦杏仁、郁金、薄荷、红花、菊花、黄芩、黄芪、栀子及白芍这12味中药萃取物(石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相),筛选出了具有抗耳毒性的活性组分,包括香附乙酸乙酯相、蝉蜕正丁醇相、苦杏仁正丁醇相、郁金乙酸乙酯相、薄荷正丁醇相及地龙的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相,以便后期对其抗耳聋机制进行研究。(4)将华南毛蕨内生真菌CYC6和CYC18进行大规模发酵,从其次级代谢产物中分离了CYC6-1,CYC6-2,CYC6-3及CYC18-1四个化合物并解析出结构,后期进一步筛选发现CYC6-2和CYC6-3具有较弱的抗耳毒活性。
【图文】：

受精卵,斑马鱼,幼鱼,不同时期

的孵化及保存丰年虾卵置于冰箱冷冻室进行保存。本实验采喂前两天，将约一管丰年虾（10 mL）置于 500（约 7g）的自来水（450 mL）加入塑料瓶内，化出的丰年虾。再将上层未孵化的死虾及残余虾受精卵的收集与孵化实验室繁殖有配对产卵和人工授精两种方法，大，故本实验斑马鱼受精卵采用配对繁殖方法鱼加大饲料量进行营养强化。具体操作[91]如下于繁殖盒底部，插好隔板，再将处理过的自来例 2:3 置于繁殖盒内，雌鱼和雄鱼通过隔板分予充分光照并让其相互追逐，可见雄鱼与雌鱼时完成排卵受精过程。每半小时收集一次，收

示意图,斑马鱼,毛细胞,示意图

图 2-2 斑马鱼神经丘毛细胞（A：DASPEI 染色；B：示意图[92]）Figure 2-2 The hair cell of Neuromast fluorescence from zebrafishA: DASPEI staining; B: Schematic diagram[92]解 DMSO 对斑马鱼的作用，结合参考文献[93,94]设计具体实验步骤5 dpf的斑马鱼幼鱼按3尾/孔置于96孔板中，并分别置于浓度为0 中孵育 6、4、2 小时，孵育结束后幼鱼用胚胎液润洗 3 次，再加005%的 DASPEI 进行染色，15 min 后用空白培养液润洗 3 次，再mL 的 MS222（200 μL）进行麻醉，5 min 后结束麻醉并用空白胚。玻片上滴加几滴 3%甲基纤维素，再用滴管将麻醉后的斑马鱼滴用纸巾轻轻擦拭玻片周围，，并吸去滴管带入的水使鱼固定于甲基显微镜（蓝光激发）调整观察体位，以便于对毛细胞进行形态学观察过程中注意避光，并尽量减少观察时间以防荧光淬灭。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285

【参考文献】