基于整合策略的四逆汤干预溃疡性结肠炎作用及机制研究

发布时间：2020-05-20 08:39

【摘要】：1 研究目的经典名方在中医诊疗体系中一直发挥着重要作用,源于经典名方的中成药临床重定位研究,有利于其临床价值的发挥。本文以经典名方四逆汤(Sini Decoction,简称SNT)为范例,采用“网络药理学预测-动物实验验证-蛋白质组学分析”整合研究策略,针对下利清谷这一主症,进行了其适应症的研究与再评价,对SNT干预溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)的作用进行了发现、药效评价与初步机制研究,为实现SNT临床重定位奠定基础。2 研究方法和结果2.1基于生物信息学的四逆汤作用预测通过BATMAN-TCM数据库收集SNT组方中药的化学成分,并进行“成分-靶标”的预测。经GO和KEGG显著性富集分析SNT潜在药物靶标所涉及的分子、功能和生物途径,同时使用OMIM、TTD和DAVID 6.8数据库进行多源显著性富集分析SNT潜在作用消化系统疾病。根据数据库收集SNT三味药共335个化学成分,共预测得到1009个相应的靶点,且化学成分之间存在共同作用靶标。其中,附子与干姜共有靶标有143个;附子与甘草之间共有靶标有146个;干姜与甘草之间共有靶标有396个;三味药共有靶标有110个,提示SNT中三味药之间存在潜在的配伍理念。通过功能富集分析发现,SNT特异性作用于肝脏、胃、结肠和小肠等消化器官。此外,SNT还富集分布于结直肠癌细胞、十二指肠、胃癌细胞、直肠、食管、肠等消化系统。SNT所涉及的临床疾病富集分析结果,提示了 SNT作用消化系统疾病可能涉及UC。最后,基于前期古代临床医案挖掘、现代中医临床用药经验分析,结合网络药理学分析结果及疾病出现频次,同时兼顾疾病转化规律和后续实验的可行性,通过整合分析,提示了 SNT下利清谷症消化系统临床定位和UC的潜在关联。2.2四逆汤干预TNBS诱导的急性溃疡性结肠炎大鼠的药效研究鉴于上述临床重定位的预测结果,为考察SNT和UC之间的关联,选择2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)法诱导的急性 UC模型进行药效研究和验证。根据大鼠体重随机分为TNBS诱导组和空白组,其中TNBS诱导组进行TNBS造模。对造模成功的大鼠依照体重和造模严重程度分层随机分为模型组、SNT(19.2、9.6、4.8g·kg-1)组和SASP(柳氮磺吡啶肠溶片,Sulfasalazine Enteric-coated Tablets,SASP)组。造模观察三天后开始给药。SNT组分别按照相应剂量灌胃给药。阳性药SASP组以0.5 g·kg-1剂量灌胃给药SASP混悬液,其余给予等体积生理盐水。实验期间采用一般观察和疾病活动指数(disease activity index,DAI)评价UC大鼠状态。给药结束后,ELISA方法检测各组大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2表达量;Griess法检测各组血清中NO含量;结肠粘膜损伤指数(colonmucosa damage index,CMDI)评价和HE染色评价大鼠结肠损伤程度。结果发现,UC大鼠较正常组DAI增加,CMDI显著升高,血清中TNF-α、PGE2和IL-6水平显著上升,并具有上调NO表达的趋势,提示造模成功。SNT可明显改善UC大鼠腹泻、便血、改善结肠粘膜充血、水肿、损伤和黏连等症状,可显著下调血清TNF-α、PGE2、IL-6表达水平,并具有下调NO表达的趋势。此外,较阳性药SASP组,SNT各组对TNF-α、PGE2、IL-6表达水平的下调能力更具优势。初步认为SNT19.2、9.6、4.8g·kg-1组均可显著改善中轻度UC肠粘膜损伤等症状,通过下调TNF-α、PGE2和IL-6表达水平发挥抗UC的药效,且效应优于SASP。基于此,本文从动物实验的角度验证了 SNT干预UC的药效作用,进一步为SNT下利清谷症消化系统临床定位与UC间的关联提供实验依据。2.3四逆汤干预溃疡性结肠炎作用机制和关键靶标研究为进一步分析SNT干预UC作用机制,在SNT药效作用基础之上,采用蛋白质组学技术,分析空白组、模型组和SNT组(9.6g·kg-1)大鼠远端结肠蛋白表达情况,经多重检验校正后进行差异蛋白筛选,以及GO和KEGG功能富集分析,结合文献调研筛选潜在关键蛋白并验证。经分析,筛选出78个SNT调节UC的关键差异蛋白,包括26个上调蛋白和52个下调蛋白,阐释了 SNT对UC的多靶点调节作用。结合生物信息学分析,初步认为SNT可能通过作用内膜、胞外区域、细胞质囊泡腔等部位的蛋白互作网络发挥干预作用。SNT调节的蛋白参与了糖胺聚糖结合、硫化合物结合、钙离子结合、TLR4结合、细胞外结构组织、胞吐作用、细胞外基质组织、中性粒细胞脱颗粒、细胞分泌等过程。共筛选出 CRP、MPO、CAMP、S100A9、S100A8、SPARC、COL12A1 和 ELANE 等16个关键蛋白。将CRP和COL12A1作为潜在的待筛选的靶标,其中CRP是临床已知的UC生物标志物。并通过ELISA实验,确证了 SNT对临床常用生物标志物CRP的下调作用,验证了 SNT对新的潜在关键靶标COL12A1的下调作用。提示SNT可能通过降低结肠和血清CRP和COL12A1的蛋内表达发挥干预UC作用,以及COL12A1具有作为新的潜在关键靶标价值。综上,本文进一步确证了 SNT下利清谷症与UC的关联性,初步阐明了 SNT干预UC药效作用机制。3 结论本研究利用整合策略,初步将SNT主治证下利清谷新定位为消化系统疾病UC,并观察了其治疗效果,发现SNT可改善粪便粘稠度、抑制便血等症状,修复中轻度UC大鼠结肠粘膜损伤,下调血清TNF-α、PGE2、和IL-6表达水平,且效应优于SASP。此外,SNT还通过调节78个UC的关键差异蛋白发挥干预UC的药效作用,其中CRP和COL12A1可作为SNT干预UC的潜在关键靶标。该整合研究策略,对SNT进行了临床重定位,并对经典名方的二次开发提供了有效的示范。
【图文】：

图１－１四逆汤各药间共有靶标分析（ＧＡＮＣＡＯ：甘草；ＧＡＮＪＩＡＮＧ：千姜；ＦＵ逡逑ＺＩ：附子）逡逑

基于整合策略的四逆汤干预溃疡性结肠炎作用及机制研究

图１－２四逆汤潜在靶点的组织特异分布逡逑
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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