石莲花对TGF-βi诱导的体外肺纤维化细胞模型的影响

发布时间：2020-05-20 12:43

【摘要】：目的:观察石莲花溶液(Graptopetalum solution,GP)对转化生长因子-β1(transforming growth factor beta-1,TGF-β1)介导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞和人肺成纤维细胞系HLF细胞所构建的体外肺纤维化细胞模型的影响,探讨石莲花溶液是否具有抗肺纤维化的作用。方法:第一部分,采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞构建体外肺纤维化模型,通过形态学观察、荧光定量PCR、Western-blot及免疫组化分析A549细胞中E钙蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I,Col-I)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)mRNA及其蛋白的表达来鉴定模型。进而,分别对纤维化模型A549细胞给予石莲花溶液(1250μg/mL)干预并以地塞米松(Dexamethasone,DXM)(120 μg/mL)作为阳性对照,干预时间均为48、72h,MTT法检测干预后各组A549细胞的增殖情况,流式细胞技术检测各组A549细胞的凋亡情况,荧光定量PCR、Western-blot和免疫组化检测各组A549细胞E-Cad、Col-I和FN的mRNA及蛋白的表达情况。之后,运用荧光定量PCR、Western-blot和免疫组化检测石莲花对TGF-β1诱导的Smad信号通路相关蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表达影响。第二部分,采用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人肺成纤维细胞系HLF细胞构建体外肺纤维化模型,通过荧光定量PCR、Western-blot及免疫组化分析HLF细胞中αa-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、Col-I和FN mRNA及其蛋白的表达来鉴定模型。进而,分别对纤维化模型HLF细胞给予石莲花溶液(650 μg/mL)干预并以地塞米松(120μg/mL)作为阳性对照,干预时间均为48、72h,MTT法检测干预后各组HLF细胞的增殖情况,流式细胞技术检测各组HLF细胞的凋亡情况,荧光定量PCR、Western-blot和免疫组化检测各组HLF细胞α-SMA、Col-I和FN的mRNA及蛋白的表达情况。之后,运用荧光定量PCR、Western-blot和免疫组化检测石莲花对TGF-β1诱导的Smad信号通路相关蛋白Smad2、Smad4和Smad7的mRNA及蛋白的表达影响。结果:A549细胞经5 ng/mL TGF-β1作用7天后细胞间隙增宽,细胞形态呈间质细胞的纺锤体形状样改变;与常规培养的A549细胞比较,E-CadmRNA及其蛋白的表达明显下调(p0.05或P0.01),而Col-I和FNmRNA及其蛋白的表达则显著上调(P0.05或P0.01),具有纤维化细胞的特征。石莲花溶液和地塞米松对纤维化模型A549细胞的增殖均具有抑制作用(IC50=1249.617 μg/mL和 118.713 μg/mL),并促进其凋亡(与模型组比较,P0.05或P0.01),还可上调E-CadmRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.05或P0.01),而下调Col-I及FNmRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.05或P0.01);比较二者的干预效果,石莲花溶液上调E-Cad表达水平及下调Col-I及FN表达水平的作用不及地塞米松,但干预72h二者间基因及蛋白的表达差异无统计学意义(P0.05)。石莲花溶液和地塞米松均可下调Smad2和Smad4 mRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.01),并上调Smad7 mRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.01);比较二者的干预效果,石莲花溶液下调Smad2和Smad4表达水平及上调Smad7表达水平的作用不及地塞米松,但干预72h二者间蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。HLF细胞经5ng/mLTGF-β1作用7天后,与常规培养的HLF细胞比较,α-SMA、Col-I和FN mRNA及其蛋白的表达则显著上调(P0.05或P0.01)。石莲花溶液和地塞米松对纤维化模型HLF细胞的增殖均具有抑制作用(IC50=647.620μg/mL和117.939μg/mL),并促进其凋亡(与模型组比较,p0.01),还可下调α-SMA、Col-I及FN mRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.05或P0.01);比较二者的干预效果,石莲花溶液下调α-SMA、Col-I及FN表达水平的作用不及地塞米松,但干预72h除石莲花溶液对FN蛋白的调节,二者间的差异无统计学意义(P0.05)。石莲花溶液和地塞米松均可下调Smad2和Smad4mRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.05或P0.01),并上调Smad7 mRNA及其蛋白的表达水平(与未干预组比较均为P0.05或P0.01);比较二者的干预效果,石莲花溶液下调Smad2和Smad4表达水平及上调Smad7表达水平的作用不及地塞米松,但干预72h二者间蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:(1)TGF-β1可介导人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞间质转化和增殖,也可介导人肺成纤维细胞系HLF细胞向肌成纤维细胞的活化和增殖,表明,两种类型细胞的体外肺纤维化模型构建成功。(2)石莲花溶液可抑制TGF-β1诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞的增殖,促进该细胞凋亡,并可抑制该细胞的上皮间质转化(EMT)。(3)石莲花溶液能够抑制由TGF-β1介导的人肺成纤维细胞系HLF细胞向肌成纤维细胞的活化增殖,并促进细胞的凋亡。(4)石莲花溶液能够降低Smad2和Smad4 mRNA和蛋白的表达量,并升高Smad7 mRNA和蛋白的表达量,提示石莲花溶液干预肺纤维化过程可能是通过对TGF-β1/Smad通路的调节。
【图文】：

细胞形态学,演变过程,细胞

时问（ｆｃ，逡逑注：与其他各浓度组比乾叩＜０．０５逡逑图１－１邋Ａ５４９细胞在不同浓度ＴＧＦ－ｐｉ刺激下生长曲线逡逑１．２确定建模所需时间逡逑Ａ５４９细胞经５ｎｇ／ｍＬ邋ＴＧＦ－ｐｉ体外诱导培养，每日倒置显微镜下观察可见模型组细胞随逡逑着时间的延长，，间隙增宽，由原有的鹤卵石形状逐渐变成纺锥体形状，且部分细胞边缘可逡逑见毛刺样改变，在第７天，Ａ５４９细胞完全由上皮细胞形态转化为间质细胞的形态，而对照逡逑组并无明显的改变（图１－２）。因此，确定７天为Ａ５４９细胞体外构建肺纤维化细胞模型的所逡逑需时间。逡逑WW逡逑对照组１天逦对暖组３天逦对膀}D７天逦逡逑曲曲逡逑ＴＧＦ－ｐｌ巧导４天逦ＴＧＦ韦１诱將５天逦ＴＧＦ－ｊＳｌ巧导６天逡逑ＴＧＦ书１巧导７天逡逑图１－２模型组Ａ５４９细胞形态学演变过程（ｘｌＯＯ）逡逑１７逡逑

细胞,肺纤维化,细胞模型,细胞形态学

着时间的延长，间隙增宽，由原有的鹤卵石形状逐渐变成纺锥体形状，且部分细胞边缘可逡逑见毛刺样改变，在第７天，Ａ５４９细胞完全由上皮细胞形态转化为间质细胞的形态，而对照逡逑组并无明显的改变（图１－２）。因此，确定７天为Ａ５４９细胞体外构建肺纤维化细胞模型的所逡逑需时间。逡逑WW逡逑对照组１天逦对暖组３天逦对膀}D７天逦逡逑曲曲逡逑ＴＧＦ－ｐｌ巧导４天逦ＴＧＦ韦１诱將５天逦ＴＧＦ－ｊＳｌ巧导６天逡逑ＴＧＦ书１巧导７天逡逑图１－２模型组Ａ５４９细胞形态学演变过程（ｘｌＯＯ）逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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