四种飞蝗解毒酶对农药降解效果分析及在黄芪药材中的应用初探

发布时间：2020-05-20 17:26

【摘要】：选题依据:农药残留,指的是农药使用后残存于生物体、农副产品和环境中的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。中药材中农药残留问题目前已成为制约中药安全用药及出口的一大因素。在各类农残的脱除方法中,理化方法由于去除效果差或二次残留等缺点不适用于药材中农残的脱除,基于基因工程技术的生物酶降解法由于能够很好解决多种农残共存留问题,同时降解效率高且不破坏中药材的外形等优势,将成为一种新兴、绿色的中药材农药脱除方法。昆虫解毒酶主要参与昆虫体内各类物质的代谢解毒,前期研究表明羧酸酯酶(Carboxylesterase,Ces)和谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase,GST)可参与多种农药的体内解毒过程。黄芪来源于蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge的干燥根,具有补气固表,利尿消肿,敛疮生肌等功效。其作为山西省主要道地药材之一,已经成为山西中药材行业的经济支柱之一。黄芪为根类药材,残留于土壤中的有机氯农药很容易浸入根部,而有机氯农药又极难降解。2015版《中国药典》第一部中专门对黄芪农残限量做出规定。课题组经文献调研发现黄芪存在一定的农药残留问题。因此,开展以黄芪为载体的根类药材农残脱除方法研究对于未来黄芪的安全用药具有重要的科学意义。基于上述现状,本课题旨在筛选能够高效代谢农药的昆虫羧酸酯酶和谷胱甘肽硫转移酶,并以黄芪为载体探究生物酶对药材农残降解的应用可行性,为药材农残脱除提供新的思路与方法。目的:通过体外过表达,UPLC及体内敲除等技术筛选飞蝗(Locusta migratoria)体内具有高效农药代谢活性的昆虫解毒酶;并以黄芪为研究对象探究解毒酶对于药材表面农药残留的代谢效率并评价解毒酶对黄芪指标性成分含量的影响。方法:(1)采用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统对飞蝗羧酸酯酶LmCesA1进行体外真核表达,并对其进行酶学特性及最适反应条件分析;采用大肠杆菌对飞蝗谷胱甘肽硫转移酶3种LmGSTs进行体外原核表达并检测其最适反应条件;(2)通过UPLC方法检测四种飞蝗解毒酶对马拉氧磷、马拉硫磷、p,p’-DDT和溴氰菊酯的体外代谢活性;(3)通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默飞蝗体内相关LmGSTs基因,并结合农药生物学测定实验检测飞蝗对农药的敏感度变化,对LmGSTs进行体内功能验证;(4)以黄芪作为研究对象,选择活性最强的LmGSTE4检测其对于黄芪表面马拉硫磷的降解效果,并检测黄芪指标性成分之一毛蕊异黄酮葡萄糖苷(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)的含量,进而研究LmGSTE4对黄芪药用成分的影响。结果:(1)成功构建LmCesA1真核表达载体,并在Sf9细胞中表达出具有活性的蛋白,其大小为60 kDa左右,并通过镍柱结合阴离子交换柱纯化得到单一的目的条带;以α-NA和β-NA为底物对其进行酶学特性分析,发现其最适反应条件为pH8,27℃左右;体外农药抑制实验发现马拉氧磷对其有明显的抑制效果;UPLC结果显示,在实验的反应体系下,LmCesA1不参与马拉氧磷、马拉硫磷和溴氰菊酯的体外代谢;(2)采用大肠杆菌对3种LmGSTs进行体外原核表达,通过镍柱纯化在250 mM咪唑洗脱缓冲液中得到单一的目的条带;以CDNB为底物检测其最适反应条件,结果显示三个酶的最适pH为pH 6-8,最适温度范围为20-30℃;杀虫剂抑制实验发现马拉硫磷能够抑制LmGSTE4和LmGSTS2活性;UPLC结果发现LmGSTE4和LmGSTS2能够代谢马拉硫磷,同时LmGSTE4能够将p,p’-DDT代谢为p,p’-DDE;(3)RNAi结合农药的生物学测定实验结果显示:沉默LmGSTe4和LmGSTs2后飞蝗对马拉硫磷敏感度显著升高;沉默LmGSTe4后飞蝗对p,p’-DDT敏感度无明显变化;(4)将纯化的LmGSTE4蛋白应用于黄芪表面马拉硫磷农药的降解能力初探,研究结果显示:经LmGSTE4处理后马拉硫磷含量降低28.3%;涂抹LmGSTE4对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量无影响。结论:本研究通过体内体外实验筛选出能够高效代谢马拉硫磷的飞蝗解毒酶LmGSTE4和LmGSTS2,并初步探索了该酶在根类药材黄芪农残脱除中的应用。
【图文】：

图 1.1 2007-2016 年中药材农药残留研究相关文章篇数图 1.2 2007-2016 年有机氯农药（A）、有机磷农药（B）和拟除虫菊酯类农药（C）残留的研究现状知网”网站搜索“中药材、农药残留”以及“PubMed

图 1.2 2007-2016 年有机氯农药（A）、有机磷农药（B）和拟除虫菊酯类农药（C）残留的研究现状国知网”网站搜索“中药材、农药残留”以及“PubMed”es residue”和“traditional Chinese medicine”，对 2007-2016目进行统计筛查。由图 1.1 可知，中药材农药残留研究形势，与过去的 7 年相比，近 3 年对药材农药残留的相关研究有低谷。与 2013 年研究文章的篇数（36 篇）相比，2014 年 2015 年虽然相关文章数有所增长，但也仅为 22 篇，与 持平。同时分别对中药材中涉及有机氯农药、有机磷农药和究现状进行筛查统计，，结果见图 1.2。目前中药材农残现状药材农残相关研究文章数目相对往年的研究却不增反减（2间比例的失衡，值得我们中药材行业人员的深思。农药残留现状及危害
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R282.710.2

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本文编号：2672952