基于circRNAs探讨川芎-赤芍药对活性成分干预AS斑块血管新生的分子机制

发布时间：2020-05-20 18:12

【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块破裂是心脑血管病死亡的主要原因,而斑块内血管新生易加速斑块进展、诱发斑块破裂出血,因此,抑制斑块血管新生可能是延缓斑块进展、增加斑块稳定性的潜在疗法。活血化瘀方药治疗AS有良好疗效,其中川芎-赤芍药对有抗AS的作用,而川芎-赤芍药对代表性活性成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)、芍药苷(paeoniflorin,PF)对AS斑块血管新生的作用尚未见相关研究。环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)可进行基因的转录或转录后调控,与微小RNAs(microRNAs,miRNAs)竞争性结合,作为miRNAs的“海绵”影响miRNAs对靶基因的调节作用,而TMP、PF配伍是否可通过调控circRNAs及相关靶基因干预AS斑块血管新生尚不清楚。1.目的尝试发现与AS及血管新生相关的特异性分子标记物,评价TMP、PF配伍对AS斑块血管新生的作用,并基于circRNAs探讨TMP、PF配伍干预AS斑块血管新生的分子机制及靶点。2.方法(1)AS差异表达circRNAs筛选及血管新生相关circRNA-miRNA-mRNA网络构建基于西苑医院AS血瘀证患者和健康人的转录组测序结果以及文献检索结果,本研究进一步筛选与AS相关的circRNAs,预测与靶circRNAs对应的miRNAs及mRNAs,构建与AS及血管新生相关的circRNA-miRNA-mRNA网络,初步确定与AS及血管新生相关的circRNAs、miRNAs、mRNAs和靶蛋白。(2)TMP、PF配伍对ox-LDL诱导的血管新生的作用及机制研究不同浓度的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立体外血管新生模型,HUVECs分为正常组、模型组、TMP组、PF组、TMP+PF组,分别单独或配伍给予不同浓度的TMP和PF(10、1、0.1、0.01 μmol/L),给药24h后MTT检测细胞增殖。借助Chou-Talalay联合指数法进行TMP和PF的协同作用分析,初步得到TMP、PF配伍最佳药效比例。然后用TMP、PF及最佳配伍干预ox-LDL诱导的HUVECs,分为正常组、模型组、TMP组、PF组、TMP+PF组、辛伐他汀组。Ox-LDL诱导HUVECs,11μmol/LTMP、10μmol/LPF、11μmol/LTMP+10μmol/LPF、1μmol/L辛伐他汀分别干预24h后,免疫荧光染色检测血管内皮标志物CD31、血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)表达,MTT法检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,细胞管状形成实验检测细胞成管,ELISA检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,Western Blot检测VEGF受体2(VEGF receptor2,VEGFR2)、Notch通路相关蛋白(Jagged1、Notch1、Hes1)的表达。(3)基于circRNAs探讨TMP、PF配伍干预AS血管新生的分子机制及靶点Ox-LDL诱导HUVECs建立体外血管新生模型,TMP、PF配伍(1μmol/LTMP+10O啨蘭ol/LPF)干预ox-LDL诱导的HUVECs,实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测筛选获得的circRNAs的表达,获得目标circRNAs并对其进行深入的RNA干扰研究。HUVECs分为正常组、模型组、TMP+PF组、TMP+PF+circRNA干预(siRNA)组、TMP+PF+circRNA干预(siRNA)+miRNA干预(inhibitor)组。用siRNA(100nmol/L)和inhibitor(100nmol/L)转染细胞24h、ox-LDL诱导、1μmol/LTMP+10μmol/LPF干预24h后,MTT法检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,细胞管状形成实验检测细胞成管,qPCR检测circRNAs、miRNAs、mRNAs表达,Western Blot检测靶蛋白的表达。(4)TMP、PF配伍对ApoE-/-小鼠AS斑块血管新生的作用及机制研究以C57BL/6J小鼠为正常对照,ApoE-/-小鼠分为模型组、TMP+PF组(低剂量1 mg/kg/d+10mg/kg/d、中剂量2mg/kg/d+20mg/kg/d、高剂量5mg/kg/d+50mg/kg/d、极高剂量10mg/kg/d+100mg/kg/d)、辛伐他汀(2.5mg/kg/d)组、TMP组和PF组,其中TMP组、PF组分别选择最佳配伍剂量中的用药剂量。正常组给予普通饲料,其余组给予高脂饲料,喂养2个月后给药,同时继续给予高脂饲料至3个月,全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平,HE染色观察斑块面积,免疫荧光检测主动脉CD31和vWF表达以代表血管密度,ELISA检测血清VEGF表达,Western Blot检测主动脉VEGFR2、Notch1、靶蛋白的表达。3.结果(1)获得5个与AS及血管新生相关的circRNA-miRNA-mRNA网络从AS患者的转录组测序结果中筛选得到3个circRNAs,分别是circRNA_06206[即软骨新生刺激因子1的circRNA(circRNA of stimulator of chondrogenesis 1,circSCRG1)]、hsa_circ_0004417、hsa_circ_0041555;从文献检索结果中得到 2 个 circRNAs,分别是has_circ_0000284和hsa_circ_0003575。构建与AS及血管新生相关的circRNA-miRNA-mRNA网络,得到相关的靶基因和靶蛋白,用于后续研究。(2)TMP、PF配伍可抑制ox-LDL诱导的体外血管新生Ox-LDL可诱导HUVECs增殖,不同浓度的TMP、PF(10、1、0.1μmol/L)均有抑制ox-LDL诱导的HUVECs增殖的作用(P0.05)。利用协同作用分析发现,与其他配伍比例相比,TMP和PF在1:10配伍干预时有较好的协同效应和量效关系,在大多数Fa水平下CI值均小于1,且1 μmol/L TMP和10μmol/L PF的作用最明显,因此选取TMP和PF的配伍比例1:10进行后续研究。研究发现TMP、PF配伍(1 μmol/L TMP+10μmol/LPF)、辛伐他汀(1μmol/L)均可抑制ox-LDL诱导的HUVECs增殖、迁移、成管,降低血管新生相关蛋白CD31、VEGF、VEGFR2和Notch1表达水平(P0.05),对vWF表达无显著影响(P0.05);TMP、PF配伍还可降低Jagged1和Hes1表达水平(P0.05),而TMP、PF单独使用对Jagged1和Hes1表达无显著影响(P0.05)。研究初步表明TMP、PF配伍可抑制ox-LDL诱导的体外血管新生,其机制可能与抑制VEGF通路和Notch通路有关。(3)TMP、PF配伍可能通过调控circSCRG1发挥抑制血管新生作用Ox-LDL诱导后circSCRG1表达水平降低、hsa_circ_0003575表达水平升高,TMP、PF配伍可升高circSCRG1表达水平(P0.05),因此选择circSCRG1进行后续的干扰研究。结果显示,TMP、PF配伍可抑制ox-LDL诱导的HUVECs增殖、迁移、成管,降低核受体4A1(Nuclear receptor4A1,NR4A1)蛋白表达水平(P0.05),给予circSCRG1的siRNA干预后TMP、PF配伍未表现出抗血管新生作用,未能降低NR4A1表达水平(P0.05),而给予hsa-miR-1268b抑制剂干预后,TMP、PF配伍又表现出抗血管新生作用。因此,TMP、PF配伍抑制ox-LDL诱导的血管新生的作用可能是通过调控circSCRG1,进而调节hsa-miR-1268b的靶蛋白NR4A1表达而实现。(4)TMP、PF配伍可抑制斑块血管新生而抗ASAS模型小鼠体重升高,血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平升高,HDL-C水平降低(P0.05);主动脉CD31、vWF、VEGFR2、NR4A1表达水平升高,缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶2(hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase 2,PHD2/EGLN1)、SAM和SH3包含结构域1(SAM and SH3domain containing1,SASH1)表达水平降低(P0.05);斑块内新生血管密度增多,斑块面积增大(P0.05)。TMP、PF配伍高剂量、辛伐他汀均可降低小鼠体重和血清TG水平,减小斑块面积与管腔面积比值,降低主动脉CD31表达水平而减少斑块内新生血管密度(P0.05);TMP、PF配伍高剂量还可降低血清LDL-C水平,降低主动脉VEGFR2、靶蛋白NR4A1表达水平(P0.05)。因此,TMP、PF配伍可能通过抑制斑块血管新生而发挥抗AS的作用,其中的关键靶点可能为VEGFR2和NR4A1。4.结论TMP、PF配伍可抑制ox-LDL诱导的HUVECs体外血管新生及ApoE-/-小鼠主动脉斑块血管新生,发挥抗AS的作用;其抗血管新生的分子机制可能与调控circSCRG1进而调节hsa-miR-1268b的靶蛋白NR4A1表达、抑制VEGF/VEGFR2通路有关。
【图文】：

ＭＡＰＫ）通路、细胞夕卜信号调节激酶通路（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ，邋ＥＲＫ）逡逑等相互作用共同参与血管新生的调控因而血管新生是多因子、多通路紧密联系、逡逑互相调控的过程（图１）。逡逑ＶＥＧＦ逦ＶＥＧＦ逡逑、Ｎｏｘ４逦ＣＲＰ逦ＩＬ－８、ＩＬ－１逦ＭＭＰ逡逑ＨＩＦ－ｌｏｔ逦？Ｆ－ｎ逦ＶＣＡＭ－１逡逑１１邋Ｉ１）逦ｉ逦ｉ＇ｉ邋ｒｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｔ邋１１邋ｎ邋１１邋（１１１１１邋１１邋１１邋（ｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｉ邋ＩＩ邋ｉ邋ｊ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｒ＇ｉ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｉｉ邋１１邋ｍ邋ｉｉ邋ｉｉ邋ｉ邋ｉ邋１１邋ｉ邋ｉ邋（ｉ邋ｎ邋ｉｉ邋１１邋ｒ邋ｉ邋ｒｉ邋１１邋１１１１邋ｍｉｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋Ｉｔ逡逑ＩＩ邋｜邋｜逦ｉｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦ｌ逦ＩＩ逦ｌ．＿！邋！．１邋１邋１邋ｉｌ邋＊邋Ｉ邋ｉ邋ｌ邋ｉ邋ｉ邋［邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ＬＩ邋１．１邋Ｉ邋！邋Ｍ邋Ｕ邋Ｉ，邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜，ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉｉ邋Ｉ邋ｉ邋｜邋Ｉ邋ｙ邋）邋｜邋Ｉ，邋｜邋ｉｉ邋ｊ邋ｉ邋１．１邋Ｉ，邋｜邋ｊ．邋ｉ邋１１）１１１邋ｌ邋ｉ邋Ｍ邋ｉ邋ｌ邋Ｉ邋ｌ邋ＩＪ邋Ｕ，邋！■邋１逡逑Ｊａｇｇｅｄ邋１邋ＳＨＣ逦ｐｉ３ｋ逦ＰＬＣｙ逦Ｓｒｃ逡逑N逦丨逦＾逦Ｉ逡逑Ｎｏｔｃｈ邋Ｒａｓ逦ｉ逦ＰＫＣ逦ＩＰ３

图２邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ研究；趋势逡逑ｃＲＮＡｓ的起源与功能逡逑ｉｒｃＲＮＡｓ是由外显子或内含子环化而成的，，不具有５＇端帽子和３＇端ｐｏｌｙ（Ａ）尾ｉｒｃＲＮＡｓ通过非经典剪接方式反向剪接形成，有学者发现真核细胞中ｃｉｒｃＲＮＡｓＲＮＡｓ邋（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍＲＮＡ，邋ｐｒｅ－ｍＲＮＡｓ）反向剪接而成［４】。通过不同方式剪接^uＲＮＡｓ邋主要有三种类型：外显子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ、内含子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ（ｃｉｒｃｕｌａｒ邋ｉｎｔｒｏｎｉｃ邋ＲＮｓ）、外显子－内含子邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ（ｅｘｏｎ－ｉｎｔｒｏｎ邋ｃｉｒｃＲＮＡｓ，ＥＩｃｉＲＮＡｓ）。外显子邋ｃｉｒｃＲＮ－ｍＲＮＡｓ反向剪接而成，有套索驱动环化和内含子配对驱动环化两种模型，胞质中；ｃｉＲＮＡｓ由内含子独立环化形成，主要存在于细胞核中；ＥＩｃｉＲＮＡｓ外显子中间保留了内含子目前研究发现大部分的ｃｉｒｃＲＮＡｓ由外显子序３）。逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2673003