基于LC-MS技术的苍术炮制前后主要成分药代动力学及代谢组学研究

发布时间：2020-05-20 18:55

【摘要】：目的:探讨苍术麸炒前后主要成分整合药代动力学行为的差异,以及苍术麸炒前后对脾虚大鼠内源性代谢物的组成和水平产生的不同影响,从药代动力学和代谢组学的角度解释苍术麸炒后药效增强的机理。材料与方法:1.采用液质联用技术建立一种快速、专属、灵敏和准确的大鼠血浆中白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III及苍术苷A的浓度检测方法。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm,2.1×100 mm),流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱,流速0.3 mL/min,柱温:40℃。样品室温度10℃,进样量2μL。检测方式为正离子多反应监测模式(MRM),采用电喷雾离子源(ESI源),电离电压为3.00 KV,去溶剂气温度为400℃,去溶剂气流速为800 L/Hr,核心气体流速为150 L/Hr,雾化气体压力为7 bar。方法学验证参考FDA关于分析方法验证指导原则和SFDA对用于药代动力学研究方法学的要求,考察了精密度和准确度、基质效应、稳定性(室温稳定性、反复冻融、长期稳定性)等参数。2.以SPF级别的SD大鼠为实验研究对象,将大鼠随机分为空白对照组、生苍术组、麸炒苍术组。生苍术组和麸炒苍术组分别灌胃给予一定剂量的生苍术和麸炒苍术提取液,对照组给予等量生理盐水。给药后0.083,0.016,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12 h大鼠眼眶取血,样品处理后,采用上述建立的测定方法测定其中各主要成分的血药浓度,经DAS3.0程序处理数据,比较生苍术和麸炒苍术中主要成分的药动学参数,绘制药时曲线,阐明麸炒是否能促进指标成分的吸收,提高其生物利用度;并根据苍术中各成分曲线下面积(AUC_(0-t)),计算白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III及苍术苷A在大鼠血浆中的综合血浆浓度,进一步估算这四种成分的整合药代动力学参数。3.本文以SPF级别的SD大鼠为实验研究对象,将SD大鼠随机分为正常组、模型组、生苍术组和麸炒苍术组,采用饮食不节、过度疲劳及苦寒泄泻的方法造成大鼠脾虚模型,选用酶联免疫分析法(ELISA)测定各组大鼠生化指标VIP、SS、SP和SDH的含量,并比较各组间含量差异;采用液质联用代谢组学分析方法,并结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA),对脾虚模型组与正常对照组代谢产物进行比较,寻找脾虚差异性代谢产物。4.运用液质联用代谢组学分析方法,结合OPLS-DA模式识别技术分析苍术麸炒前后对脾虚大鼠血浆中差异性代谢物的影响,确认生苍术和麸炒苍术作用的差异性代谢产物。结果:1.实验结果显示,建立的UPLC/MS-MS方法具有较高的特异性和灵敏度,可应用于同时测定灌胃苍术提取物后大鼠血浆中白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III和苍术苷A的浓度。4种被测成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,精密度和稳定性等均符合要求。2.SD大鼠灌胃生苍术提取液后,测得大鼠血浆中白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III和苍术苷A的最大血药浓度Cmax分别为32.088±2.05 ng/mL、49.616±7.692 ng/mL、87.041±17.025 ng/mL和57.80±21.65 ng/mL;大鼠灌胃麸炒苍术提取液后,测得大鼠血浆中白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III和苍术苷A的最大血药浓度Cmax分别为66.94±10.89 ng/mL、55.9±13.58 ng/mL、113.10±19.04 ng/mL和69.38±8.29 ng/mL。苍术经麸炒后,白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III和苍术苷A的最大血药浓度均有不同程度的升高;整合药代动力学结果显示灌胃生苍术提取液和麸炒苍术提取液后,最大血药浓度Cmax分别为54.17±7.16 ng/mL和70.02±5.16ng/mL。3.与正常组相比,模型组血清中VIP、SS、SP和SDH的含量均下降;与模型组相比,生苍术组与麸炒苍术组血清中VIP、SS、SP和SDH的含量均升高,且麸炒苍术的效果要优于生苍术。代谢组学研究结果显示,与正常组相比较,脾虚大鼠血浆中共筛选出17种对分类有显著贡献的脾虚差异性代谢产物,其中正模式下发现9种,分别是糖原、油酸、烟酸、磷脂酰胆碱、磷酸肌醇、二氢叶酸、胆固醇、4’-磷酸泛酸巯基乙胺和N2-Succinylglutamic acid;负模式下发现8种,分别是棕榈酰左旋肉碱、磷酸核糖胺、N-软脂酰基谷氨酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、丙氨酸、L-山梨糖、葡糖-6-磷酸和5-甲基胞嘧啶。并通过对与这些脾虚差异代谢物相关代谢通路的分析发现,脾虚的发生机制与氨基酸代谢、脂质代谢、糖代谢等密切相关。4.生苍术和麸炒苍术对上述筛选出的差异性代谢产物均具有正向调节作用,其中对二氢叶酸、4’-磷酸泛酸巯基乙胺、磷脂酰胆碱、磷酸肌醇、油酸、棕榈酰左旋肉碱、磷酸核糖胺、葡糖-6-磷酸、烟酸和丙氨酸的调节作用,麸炒苍术要优于生苍术。结论:1.通过比较生苍术和麸炒苍术中主要成分白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III和苍术苷A的最大血药浓度可知,给药麸炒苍术提取液后大鼠血浆中这四种成分的最大血药浓度均有所升高,表明麸炒可促进苍术中主要成分的吸收。2.通过代谢组学研究可知,生苍术和麸炒苍术均对不饱和脂肪酸代谢途径,葡萄糖-丙氨酸循环,棕榈酰左旋肉碱代谢途径,氨基葡萄糖代谢,磷脂酰胆碱代谢,磷酸肌醇代谢等途径有调节作用,且麸炒苍术的调节作用优于生苍术。
【图文】：

质谱图,化合物,苍术,苍术苷

(E)图 1-2 五种化合物的质谱图A），白术内酯Ⅱ（B），白术内酯Ⅲ（C），苍术苷 A（D），对乙酰术和麸炒苍术粉末各 100g（过 50 目筛），，加 10 倍量蒸馏水将药液移至旋转蒸发仪中，T=65℃，N=45r/min，浓缩至一ml 的生苍术和麸炒苍术提取物。品系列、质量控制样品（QC）及内标溶液的配制品溶液的配制：精密称取白术内酯Ⅰ3.5mg，白术内酯Ⅱ5.0术苷 A 4.3mg，置于 100mL 容量瓶中，加适量甲醇溶解定容酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷 A 分别为 35μg/mL3μg/mL 的混合对照品储备液，于 4℃下保存备用。、高三个浓度的混合对照品溶液，氮气流下吹干，加入一定

色谱图,色谱图,血浆,苍术

图 1-3 血浆样品中白术内酯ⅠUPLC- MS/MS 色谱图白血浆（A）；空白血浆加白术内酯Ⅰ（3.2 ng/mL）（B）；灌胃生苍术 1.5h 后血浆（C）；胃麸炒苍术 1.5h 后血浆（D）1：白术内酯 ⅠA2B
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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