血必净通过AMPK通路影响脂多糖诱导大鼠调节性T细胞免疫代谢的研究

发布时间：2020-05-21 04:50

【摘要】：目的:本实验应用脂多糖体外刺激SD大鼠脾脏组织调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)模拟脓毒症时Treg细胞免疫状态,予以血必净干预后,通过检测Treg细胞特异性标志物及功能、代谢相关细胞因子水平变化情况,以及共培养条件下对效应性T细胞(Effective T cell,Teff)增殖分化和辅助性T细胞(T helper cell,Th)分化漂移的影响,以明确血必净对Treg细胞免疫功能和代谢方面的调节作用;同时在血必净应用基础上,加用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂,通过检测对Treg细胞代谢和AMPK信号通路相关蛋白表达情况的影响,以阐明AMPK在血必净调节脓毒症Treg细胞免疫功能中的作用。方法:1.磁激活细胞分选法(MACS)分选出正常SD大鼠脾脏组织CD4~+CD25~+Treg及CD4~+CD25~-Teff细胞,流式细胞术检测细胞纯度;将体外分离的Treg细胞分为对照组、抗CD3/CD28组、抗CD3/CD28+LPS组、抗CD3/CD28+LPS+血必净组,培养72h;2.流式细胞术(FCM)检测CTLA-4/Foxp3表达,使用ELISA法检测Treg细胞上清中IL-10、TGF-β浓度;3.Treg与Teff按照细胞数1:1共培养68h后,CFSE染色法测Teff细胞的增殖,使用ELISA法测定共培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ浓度;4.FCM检测Treg的CPT-1和GLUT1强度和细胞内活性氧(ROS)水平;5.将提取到的Treg细胞分为对照组、抗CD3/CD28组、抗CD3/CD28+LPS组、抗CD3/CD28+LPS+A-769662组、抗CD3/CD28+LPS+血必净组、抗CD3/CD28+LPS+血必净+A-769662组,重复上述实验。用WB方法检测各组p-AMPKα和AMPKα表达。结果:1.抗CD3/CD28+LPS组CTLA-4、Foxp3表达量、IL-10/TGF-β浓度最高,对Teff增殖的抑制能力最强,并且抗CD3/CD28+LPS组IFN-γ/IL-4浓度比值最低;抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组Treg细胞CTLA-4、Foxp3表达量以及上清中IL-10和TGF-β含量明显降低(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净组CD4~+CD25~-Teff细胞Divided%显著高于抗CD3/CD28+LPS组(P0.05),共培养上清中IFN-γ/IL-4浓度比值也明显升高(P0.05);2.FCM结果显示:抗CD3/CD28+LPS组CPT-1和GLUT1表达显著高于其余各组(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组接近于抗CD3/CD28组(P0.05)。抗CD3/CD28+LPS组Treg细胞内ROS含量为1014.333±49.136,显著高于其余各组(P0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组Treg细胞内ROS含量接近正常;3.与抗CD3/CD28组相比,抗CD3/CD28+LPS组p-AMPKα表达显著增加(P0.05),抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组AMPKα磷酸化显著降低(P0.05);与抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组相比,抗CD3/CD28+LPS+血必净+A-769662组AMPKα磷酸化水平明显升高(P0.05)。结论:1.血必净能有效缓解体外细胞模拟脓毒症调节性T细胞免疫抑制状态;2.在体外模拟脓毒症状态下,Treg细胞主要的代谢方式是FAO和糖酵解,使用血必净能有效抑制两种代谢方式,并且通过减少细胞内ROS的水平,避免脓毒症时线粒体的损伤;3.血必净通过限制AMPKα磷酸化影响LPS刺激调节性T细胞免疫代谢。
【图文】：

大学硕士学位论文 一、血必净对脂多糖诱导大鼠调节性 T 细胞免疫功能结果D4+CD25+Treg 细胞纯度与活性 SD 大鼠脾脏单个核细胞经由 MACS 磁珠两次阳选后，CD4+CD2平均为(95.23±1.46)%(图 1.1)。根据台盼蓝排斥实验测定所获25+Treg 细胞的活性为(93.34±2.01)%，满足进行后续实验操作的要

图 1.2 CD4+CD25+Treg 细胞表面标志物 CTLA-4 及转录因子 Foxp31.3.3 CD4+CD25+Treg 细胞上清液中 IL-10、TGF-β 的浓度抗 CD3/CD28+LPS 组 Treg 细胞上清液中 IL-10 和 TGF-β 水平最高，，显于其余各组(P<0.05)；和抗 CD3/CD28+LPS 组相比，抗 CD3/CD28+LPS+血(20μl/ml)组能有效降低上清中 IL-10 含量(P<0.05)，但不能将 IL-10 含量恢复常水平。而抗 CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组上清中的 TGF-β 浓度接近常对照组和抗 CD3/CD28 组(P>0.05)。表 1.2 CD4+CD25+Treg 细胞上清液中 IL-10、TGF-β 的浓度分组 IL-10(pg/ml) TGF-β(pg/ml)对照组 91.783±2.075 403.750±16.750抗 CD3/CD28 组 95.859±6.125 416.961±23.871抗 CD3/CD28+LPS 组 378.863±25.810ab511.284±29.209a抗 CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组 265.208±48.701abc450.703±38.784c注：a：与对照组比较，P<0.05；b：与抗 CD3/CD28 组比较，P<0.05；c：与抗 CD3/CD28
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2673750