川芎和丹参对肺癌干细胞样细胞血管生成拟态的干预和机制研究

发布时间：2020-05-21 05:40

【摘要】：背景:肺癌目前是我国乃至全球死亡率最高的恶性肿瘤,近年来发现血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是肿瘤血管生成的另一途径,与肺癌的不良预后密切相关。乏氧是诱导VM形成的一个重要始动因素,而肿瘤干细胞通过多种途径参与VM形成。前期研究发现川芎和丹参可抑制肺癌类干细胞样细胞(cancer stem-like cells,CSLCs)VEGF、HIF-1α以及EMT相关蛋白的表达,这些蛋白与VM形成机制相关。由此,我们推测川芎和丹参可能抑制肺癌CSLCs VM的形成,且在不同的氧环境下作用机制不同。目的:首先分离富集A549 CSLCs亚群,并对其干细胞特性进行鉴定;然后观察A549 CSLCs促VM形成的作用;最后明确川芎和丹参单药组和两药配伍组分别对不同氧环境下肺癌CSLCs VM形成的抑制作用及具体分子机制,旨在观察单味药及配伍后的作用效果,为中药的临床实践提供实验基础。方法:(1)采用无血清成球培养法分选A549 CSLCs亚群,并通过单细胞克隆形成实验和小鼠移植瘤形成实验检测细胞增殖能力、划痕实验检测细胞迁移能力以及流式细胞术检测肿瘤干细胞表面标志物,共同鉴定所分选的球细胞为CSLCs。(2)通过Matrigel小管形成实验检测A549 CSLCs三维小管形成能力,免疫荧光法检测内皮细胞标志蛋白CD31、vWF观察A549CSLCs向内皮细胞诱导转化能力,从而判断A549CSLCs促VM形成的作用。(3)建立A549 CSLCs荷瘤小鼠模型,分为常氧组和乏氧组,每组进一步分为对照组、川芎组、丹参组、川芎和丹参(川丹)组以及恩度组,通过激光共聚焦检测各组vWF蛋白表达,CD31/PAS双染法检测各组VM形成,观察川芎和丹参对不同氧环境下A549CSLCs VM的作用。(4)ELISA法检测VEGF的表达,RT-PCR法检测VEGF、MMP-9的mRNA表达,Western Blot法检测各组MACC1、HGF、c-MET、TWIST、VE-Cadherin、FAK、EphA2、Integrin β1、HIF-1α蛋白的表达,分析川芎和丹参对不同氧环境下A549CSLCs VM作用的具体机制。结果:(1)无血清培养的A549细胞于第3天开始形成形态较规则的细胞球,随后细胞球逐渐增大,到第5天细胞球的折光性开始降低,连续传代2次,球体更加立体规整。单细胞克隆形成实验提示A549球细胞形成的单个克隆灶的细胞数目明显多于其亲代细胞,差异具有显著统计学意义(P0.05)。小鼠移植瘤形成实验发现A549球细胞较原代A549细胞更早成瘤,在30天观察时间结束时,5×105数量级A549球细胞的成瘤率为100%,原代细胞的成瘤率为80%;1×105数量级A549球细胞的成瘤率为100%,原代细胞的成瘤率为60%;1×104数量级A549球细胞的成瘤率为100%,原代细胞的成瘤率为0,说明A549球细胞较原代细胞更易成瘤。划痕实验结果显示,分别在第6h、12h和24h A549球细胞均比其原代细胞有更强的细胞迁移能力(P0.01)。流式细胞术检测发现,A549球细胞表面干细胞标志物CD44+/CD24-/low的表达量高达80.4%。(2)观察EA.hy926、A549原代细胞、常氧A549CSLCs和乏氧A549CSLCs在三维培养体系中小管形成的能力。结果显示,与A549原代细胞相比,A549 CSLCs具有较强的小管形成能力,且在乏氧环境下更明显,小管形态更接近EA.hy926形成的小管。免疫荧光检测结果显示,与常氧环境比较,A549CSLCs在乏氧环境下CD31、vWF的表达明显增加,表明在乏氧环境下A549CSLCs向内皮细胞转化的能力更明显。(3)激光共聚焦检测结果显示,常氧环境下,与对照组相比,丹参组和川丹组可促进vWF蛋白表达,其余各组均无明显差异;乏氧环境下,与对照组相比,各组之间对vWF蛋白表达无明显差异;不同氧环境比较结果,与常氧组相比,各组之间对vWF蛋白表达也无明显差异。CD31/PAS双染法结果显示,无论常氧环境还是乏氧环境,川芎组、丹参组、川丹组和恩度组均可抑制VM的形成;不同氧环境比较,各组之间无明显差异。(4)ELISA法结果显示,常氧环境下,与对照组相比,川芎组、丹参组、川丹组和恩度组均明显抑制VEGF的表达(P均0.01);乏氧环境下,各组之间对VEGF的表达无明显差异;不同氧环境比较结果,与常氧组相比,乏氧环境下各组均明显促进VEGF的表达(P均0.01),这可能与乏氧本身作为信号促进VEGF的表达有关。RT-PCR法检测VEGF的结果显示,常氧环境下,川芎组、丹参组、川丹组和恩度组均能明显抑制VEGF的表达(P均0.01);乏氧环境下,各组之间对VEGF的表达无明显差异;不同氧环境比较结果,与常氧组相比,乏氧环境下各组VEGF表达普遍增高,这可能与乏氧本身作为信号促进VEGF的表达有关。RT-PCR法检测MMP-9的结果显示,常氧环境下,川芎组、丹参组、川丹组和恩度组均能明显抑制MMP-9的表达(P均0.01);乏氧环境下,各组之间无明显差异;不同氧环境比较结果,与常氧组相比,乏氧环境下各组MMP-9表达普遍增高,这可能与乏氧本身作为信号促进MMP-9的表达有关。Western Blot法检测结果显示,常氧环境下,川芎组、川丹组和恩度组可抑制MACC1的表达,丹参组可抑制HGF的表达,丹参组可抑制c-MET的表达,丹参组和恩度组可抑制TWIST的表达,丹参组、川丹组可抑制VE-Cadherin的表达,丹参组可抑制FAK的表达,川芎组和丹参组可抑制EphA2的表达,丹参组可抑制Integrinβ1的表达;乏氧环境下,川芎组可抑制MACC1的表达,丹参组可抑制HGF的表达,川芎组可抑制c-MET的表达,丹参组可抑制TWIST的表达,丹参组可抑制VE-Cadherin的表达;川芎组、丹参组和恩度组可抑制FAK的表达,川芎组和恩度组可抑制EphA2的表达,川芎组和川丹组可抑制Integrin β1的表达。结论:(1)无血清培养法分离富集的球细胞具有干细胞样细胞的干性。(2)A549CSLCs较A549细胞有更强的促VM形成能力,且在乏氧环境下促VM形成能力更强。(3)常氧和乏氧环境下川芎、丹参以及两者配伍均能抑制VM的形成,然而,无论常氧还是乏氧环境,川芎和丹参配伍对抑制VM的形成协同作用不明显。(4)川芎、丹参以及两者配伍在不同氧环境下对VM的抑制作用机制不完全相同。
【图文】：

相关信号,瘤细胞,分子,血管内皮

因此，进一步探讨调节ＶＭ的关键分子机制将成为癌症治疗的重要方向。逡逑３邋ＶＭ通过多种途径促进癌症的复发转移逡逑ＶＭ通过调控多种分子信号通路促进肿瘤细胞的侵袭转移（如图１）。研究已经发逡逑现与ＶＭ相关的主要分子包括血管内皮粘素（ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，逡逑ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）［２３’２４］，上皮细胞激酶（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｋｉｎａｓｅ，，ＥｐｈＡ２）邋ｔ２５１，粘附斑激酶（ｆｏｃａｌ逡逑ａｄｈｅｓｉｏｎ邋ｋｉｎａｓｅ，ＦＡＫ）丨２６］，基质金属蛋白酶（ｍａｔｒｉｘ邋ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰｓ）丨２７］，逡逑血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）【２８】等。逡逑ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ不仅可以促进血管内皮细胞连接、维持血管内皮屏障功能，而且能调逡逑节邻近血管的生成［２９］。ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ仅由高度侵袭性的肿瘤细胞表达，在侵袭性较差的逡逑肿瘤细胞中检测不到，这说明存在血管生成转换的可能性。而ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ表达的下调逡逑消除了恶性肿瘤细胞形成血管网络的能力

血管平滑肌,细胞,肿瘤血管生成,靶向

图２肿瘤干细胞与ＶＭ的关系逡逑综上所述，ＣＳＣｓ既能直接或者通过转向分化为血管平滑肌样细胞参与ＶＭ形成，逡逑又能通过ＥＭＴ或分泌一些细胞因子促进ＶＭ形成（如图２所示）。然而，ＣＳＣｓ与ＶＭ逡逑之间的相互作尚有诸多问题亟待解决，如ＣＳＣｓ在肿瘤血管生成和ＶＭ形成的相同和不逡逑同的作用机制；靶向ＣＳＣｓ治疗后是否可以完全阻断ＶＭ的发生等。随着研宄的不断深逡逑入，ＣＳＣｓ在ＶＭ形成过程中的具体机制必将进一步明确，可望在肿瘤临床治疗方面取逡逑得突破性的进展。逡逑参考文献逡逑［１］逦Ｗｕ邋Ｓ，邋Ｙｕ邋Ｌ，邋Ｃｈｅｎｇ邋Ｚ，邋ｅｔ邋ａｌ．邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍａｓｐｉｎ邋ｉｎ邋ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ邋ｃｅｌｌ邋ｌｕｎｇ邋ｃａｎｃｅｒ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ逡逑ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｔｏ邋ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ邋ｍｉｍｉｃｒｙ邋［Ｊ］＿邋Ｊ邋Ｈｕａｚｈｏｎｇ邋Ｕｎｉｖ邋Ｓｃｉ邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ邋Ｍｅｄ邋Ｓｃｉ，邋２０１２，邋３２逡逑（３）：邋３４６－３５２．逡逑［２］逦Ｒｏｕｄｓａｒｉ邋ＬＣ，邋Ｗｅｓｔ邋ＪＬ．邋Ｓｔｕｄｙｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｉｎ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｍｏｄｅｌ逡逑ｓｙｓｔｅｍｓ邋［Ｊ］．邋Ａｄｖａｎｃｅｄ邋ｄｒｕｇ邋ｄｅｌｉｖｅｒｙ邋ｒｅｖｉｅｗｓ，邋２０１６，邋９７：邋２５０－２５９．逡逑［３］逦Ｈａｌｌ邋ＲＤ
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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