毛蕊异黄酮在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的保护作用及机制研究

发布时间：2020-05-21 09:37

【摘要】：目的:毛蕊异黄酮(Calycosin)是我国传统中药黄芪的主要活性成分之一,具有明显的植物雌激素(Phytoestrogens)特点。其在抗病毒以及对人类恶性肿瘤增殖的抑制作用方面表现出一定的药理学效应,近些年尤其在抗心脑血管疾病方面的作用也受到广泛关注。据报道,雌激素(Estrogen,E2)可以提供神经保护作用,在脑缺血/再灌注损伤(Ischemia and Reperfusion Injury,I/R)的动物模型中,摄入一定的植物雌激素可降低脑损伤程度。新的证据表明自噬(Autophagy)在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中起着重要作用。p62(也称为sequestosome-1/SQSTM1)是一个选择性自噬底物和多领域的支架蛋白。与p62相似,NBR1(neighbor of BRCA1 gene1)还可以调节泛素化降解。最近的研究表明,凋亡、炎症与自噬之间存在着复杂的关联。在本课题组之前的实验研究结果中,我们发现毛蕊异黄酮对大脑局灶性缺血再灌注损伤具有神经保护作用,但具体机制尚未明确。在本研究中,我们构建大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的体内模型,从分子、形态学及动物水平探讨毛蕊异黄酮在脑缺血再灌注损伤中对脑神经元的作用机制以及与相关自噬、凋亡和炎症因子的影响。方法:(1)建立成年雄性SD大鼠大脑中动脉阻塞模型,在动物体内模拟脑缺血再灌注损伤过程。(2)在MCAO模型建立后,2小时局部缺血,再灌注24小时,随机分为空白对照组(sham-operated group)、缺血/再灌注模型组(I/R group)、低浓度药物组(calycosin-treated 5mg/kg+MCAO)、中浓度药物组(calycosin-treated 10mg/kg+MCAO)和高浓度药物组(calycosin-treated 20mg/kg+MCAO),分别观察大鼠的神经行为评分(Neurological scores)、脑梗死体积(Infarct volumes)、脑组织含水量(Brain water content)的影响。通过动物实验上的对比,验证毛蕊异黄酮在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。(3)采用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR及免疫组织化学技术的方法,进一步检测大鼠大脑组织中的自噬相关蛋白p62和NBR1、凋亡因子Bcl-2以及炎症因子TNF-α表达水平。结果:经过预处理14天,毛蕊异黄酮显著减轻了缺血再灌注脑组织的损伤,明显改善了局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能,减少了脑梗死体积和脑水肿。我们观察到脑缺血再灌注后,通过Western Blot、RT-PCR和免疫组化实验,p62、NBR1和Bcl-2蛋白的表达显著降低,而TNF-α水平明显增加。而且,在MCAO模型脑组织中,随着毛蕊异黄酮药物浓度的增加,p62、NBR1和Bcl-2表达显著上调,且下调了TNF-α水平,其与毛蕊异黄酮剂量大小呈相关性。结论:我们的研究表明,植物雌激素毛蕊异黄酮通过影响大鼠大脑组织中的自噬相关蛋白p62、NBR1、凋亡因子Bcl-2以及炎症因子TNF-α水平,对大鼠缺血再灌注损伤发挥着神经保护作用,机制可能与其抗自噬,抗凋亡,抗炎症的功能作用有关。这些结果为脑卒中的治疗提供了新的思路。
【图文】：

对比 I/ R 组，10-20mg /kg 毛蕊异黄酮药物组明显降低了梗死体积和脑水肿率。这些结果表明，毛蕊异黄酮可以减轻脑缺血再灌注损伤。图1 毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤神经功能的影响。图1A是毛蕊异黄酮化学分子结构。

图 2 毛蕊异黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤中 p62 表达水平的影响。图 2A是 RT-PCR 法检测 p62的 mRNA 表达水平。图 2B 是免疫印迹法检测 p62 的蛋白表达水平。图 2C 是免疫组化染色检测 p62的平均光密度值。结果表示为平均数±标准误。△△P＜0.01，I/R 组与空白对照组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，，毛蕊异黄酮药物组与 I/R 组比较，n =3。Fig. 2. Effects of calycosin on expression levels of p62 in cerebral ischemia and reperfusion rats.Tissue from the penumbra was collected at 24 h after reperfusion and used for Quantitative real RT-PCRand western blot analysis. Sections obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded brain tissuespecimens were used for immunohistochemical analyses. (A) Calycosin increased p62 mRNA expressionlevels in I/R rats. (B) Top panel and bottom panel are representative bands and p62 relative protein levels.Calycosin increased p62 protein expression levels in I/R rats. (C) Representative p62immunohistochemically stained sections and semiquantitative density results. Calycosin treatment
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2674076