映山红花总黄酮阻断Rho激酶促进大鼠血管舒张作用的机制研究

发布时间：2020-05-21 21:17

【摘要】：Rho激酶(ROCKs)是小分子鸟苷酸结合蛋白RhoA的主要效应分子,其在血管内皮细胞和平滑肌细胞中均有一定表达,ROCK分别有ROCK1和ROCK2两种亚型,它们在氨基酸序列和激酶结构域上具有一定的同源性,ROCK在动脉粥样硬化、心力衰竭、肺动脉高压、血管重塑等心血管疾病中具有一定的生理作用。静息状态下,RhoA位于胞质中,活化后可转移到胞膜上,并活化下游的ROCK,使肌球蛋白轻链脱磷酸化酶(MLCP)的肌球蛋白结合亚基(MBS)磷酸化,导致MLCP失活,磷酸化的肌球蛋白轻链(MLC)不能脱磷酸,并且ROCK也可使MLC直接磷酸化,使平滑肌收缩性增强,最终使冠状动脉发生痉挛反应,从而引发一系列的心血管疾病,Rho激酶抑制剂Y27632可通过舒张血管来改善血管痉挛的产生。映山红花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)是从映山红花中提取的有效部位,芦丁、槲皮素、金丝桃苷等是其主要成分。我们以前报道TFR有血管舒张作用,其机制涉及到血管中RhoA活性降低。但有关TFR是否通过阻断Rho激酶而对血管产生舒张效应,从而改善血管痉挛仍有待进一步探讨。本研究通过siRNA体内干扰技术,下调了大鼠体内ROCK1、ROCK2蛋白表达,观察了TFR对血管舒张作用的变化,并探讨其作用与阻断ROCK及与ROCK亚型的关系。目的:1.观察大鼠血管舒张作用的Rho激酶阻断机制。2.探讨TFR对大鼠血管的舒张作用与ROCK及与ROCK亚型的关系。方法:1.采用siRNA体内干扰技术,建立转染模型。1.1.分别取冠状动脉、肠系膜动脉、肠系膜静脉、腹主动脉,每种血管各分为5组,分别为:(1)空白对照组(control);(2)阴性siRNA干扰组(negative);(3)转染试剂组(transfection reagent);(4)ROCK_1-siRNA干扰组(ROCK_1-siRNA group);(5)ROCK_2-siRNA干扰组(ROCK_2-siRNA group)。1.2 western blot方法测定血管组织中ROCK_1和ROCK_2蛋白的表达。2.建立血管张力实验,分别使用TFR和Y27632来检测其对正常大鼠和ROCK_1-siRNA、ROCK_2-siRNA转染的血管的舒张作用。2.1实验分组:分别取冠状动脉、肠系膜动脉、肠系膜静脉、腹主动脉,每种血管各分为:溶媒(vehicle)组、TFR组、ROCK_1-siRNA+vehicle组、ROCK_1-siRNA+TFR组、ROCK_2-siRNA+vehicle组、ROCK_2-siRNA+TFR组、Y27632组、ROCK_1-siRNA+Y27632组、ROCK_2-siRNA+Y27632组。结果:1.与对照组相比,ROCK_1-siRNA转染组的ROCK1蛋白表达和ROCK_2-siRNA转染组的ROCK2蛋白表达明显降低,而且,与对照组相比,各血管组织中的转染试剂组及阴性siRNA组ROCK_1和ROCK_2蛋白的表达并未明显降低。2.与溶媒组(ROCK_1-siRNA+vehicle)相比,Y27632可诱导ROCK1下调的大鼠冠状动脉、肠系膜动脉、肠系膜静脉、腹主动脉产生舒张效应,而与正常大鼠血管相比,Y27632对ROCK_1-siRNA干扰的血管的舒张效应明显减弱。3.与溶媒组(ROCK_2-siRNA+vehicle)相比,Y27632可诱导ROCK2下调的大鼠冠状动脉、肠系膜动脉、腹主动脉产生舒张效应,而对肠系膜静脉舒张作用不明显。与正常大鼠血管作用相比,Y27632对ROCK_2-siRNA干扰的血管的舒张作用降低。4.与溶媒组(ROCK_1-siRNA+vehicle)相比,TFR可诱导ROCK1下调的大鼠冠状动脉、肠系膜动脉、肠系膜静脉和腹主动脉产生舒张效应,与正常大鼠血管相比,TFR对ROCK_1-siRNA转染的血管的舒张效应明显减弱。5.与溶媒组(ROCK_2-siRNA+vehicle)相比,TFR可引起ROCK2下调的大鼠冠状动脉、肠系膜动脉和腹主动脉产生舒张效应,而对ROCK2下调的肠系膜静脉并未产生明显的舒张作用。且与未经过ROCK2转染的大鼠血管相比,TFR可明显减弱ROCK_2-siRNA转染的血管的舒张作用。6.Y27632对各血管的舒张作用与阻断ROCK有关,且对肠系膜静脉的舒张作用与ROCK2阻断有关,对肠系膜动脉的舒张作用与ROCK1关系更密切。7.TFR对各血管的舒张作用与阻断ROCK有关,且对肠系膜动脉、肠系膜静脉、腹主动脉的舒张作用选择性作用于ROCK2,而对冠状动脉的舒张效应与ROCK1关系更为密切。结论:1 ROCK1、ROCK2下调可减弱Y27632和TFR的血管舒张作用。2 TFR对大鼠血管的舒张作用可能与阻断ROCK有关,并对冠状动脉的舒张作用与阻断ROCK1有关,而对肠系膜动脉、肠系膜静脉、腹主动脉的舒张作用可能与ROCK2的关系更为密切。
【图文】：

蛋白表达,转染,动脉,冠状动脉

图 1. ROCK1-siRNA 和 ROCK2-siRNA 转染对大鼠冠状动脉中 ROCK1和 ROCK2蛋白表达影响（means ± SD, n =3)。Fig 1. The effects of ROCK1-siRNA and ROCK2-siRNA transfection in vivo on the expression of R-OCK1and ROCK2protein in rat coronary artery (means ± SD, n =3).注：A: ROCK1蛋白表达结果；B: ROCK1蛋白定量分析；C: ROCK2蛋白表达结果；D：ROCK2蛋白定量分析。与对照组相比，，**P < 0.01。Note: A: Representative of ROCK1protein expression; B: Quantification of ROCK1protein expressi-on; C: Representative of ROCK2protein expression; D: Quantification of ROCK2protein expression.**P < 0.01 vs. the control group.AC

蛋白表达,冠状动脉,转染,大鼠

图 1. ROCK1-siRNA 和 ROCK2-siRNA 转染对大鼠冠状动脉中 ROCK1和 ROCK2蛋白表达影响（means ± SD, n =3)。Fig 1. The effects of ROCK1-siRNA and ROCK2-siRNA transfection in vivo on the expression of R-OCK1and ROCK2protein in rat coronary artery (means ± SD, n =3).注：A: ROCK1蛋白表达结果；B: ROCK1蛋白定量分析；C: ROCK2蛋白表达结果；D：ROCK2蛋白定量分析。与对照组相比，**P < 0.01。Note: A: Representative of ROCK1protein expression; B: Quantification of ROCK1protein expressi-on; C: Representative of ROCK2protein expression; D: Quantification of ROCK2protein expression.**P < 0.01 vs. the control group.ABCD
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】