姜提取物通过LTA4H和AKT通路抑制结肠癌生长的机制研究

发布时间：2020-05-21 15:25

【摘要】：结直肠癌(CRC)是常见的消化道肿瘤之一,2012年世界卫生组织调查发现全球每年约有130多万的结直肠癌新发病例,在所有的恶性肿瘤发病率中位居第三位。其死亡率约50%,位居恶性肿瘤死亡率的第四位。近年来,我们研究发现结直肠癌的发病率、死亡率呈上升趋势。虽然我国在全球结直肠癌分布图中处于低发区域,但随着生活水平的提高,饮食结构的改变,我们结直肠癌的发病率呈上升趋势。截止2015年,我国结直肠癌新发病例数已超过37.6万,死亡病例19.1万以上。目前,手术和化疗仍是治疗结直肠癌的一种有效方法,但它的副作用极大,导致患者生活质量严重下降。因此,寻找高效、低毒,防治结直肠癌复发和转移的药物是目前结直肠癌治疗中迫切需要解决的问题。白三烯A4水解酶(LTA4H)是白三烯B4的关键酶,具有氨肽酶和环氧化物水解酶的双重活性。白三烯B4是许多炎症反应。近期有关观察到,LTA4H在一些恶性肿瘤的组织中的表达水平明显高于正常组织。LTA4H的氨肽酶可以调节肿瘤细胞的生长,影响肿瘤细胞的活性。AKT又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),它是分子量大约为60KD的蛋白,在磷脂酰肌醇-3(羟基)激酶(PI3K)的细胞信号传导通路中起着至关重要的作用。AKT在细胞的增殖、凋亡、代谢、存活等一系列细胞活动中起着重要作用,此外AKT还充当抗凋亡信号激酶的作用。AKT可分为3种亚型(AKT1、AKT2、AKT3),3种亚型的功能各异。其中,AKT1主要参与恶性肿瘤的发生和转移;AKT2参与胰岛素功能的调节;而AKT3则是主要表达在脑组织内。中成药及其有效成分预防和治疗肿瘤的作用与化学药物相比有很多优势。有研究证明中药抗肿瘤的作用机制主要表现为:(1)调控肿瘤细胞周期(2)阻滞肿瘤细胞增殖(4)调控基因表达(5)抵抗基因突变(6)诱导肿瘤细胞凋亡(7)抑制肿瘤转移(8)免疫调节。姜是姜科姜属,多年生草本植物姜的根茎,是常用的中药材,是药食两用植物。药用部分为新鲜根状茎,具有祛寒、祛湿、暖胃、加速血液循环等多种保健功能,是临床治疗恶心、呕吐、眩晕、腹痛、胃炎的常用中药。其主要的成分是姜酚。姜酚包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚、甲基-6-姜酚等。国内外学者对姜酚的分子结构、药理作用进行了大量研究,姜酚具有强心、保肝利胆、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、止痛等药理作用。在本研究中,我们利用美国明尼苏达大学Hormel研究院由老姜根中提纯的姜提取物(Ginger extract)进行研究,其主要成分包括6-Gingerol、8-Gingerol、10-Gingerol和6-Shogaol。我们发现姜提取物可以LTA4H和AKT通路抑制结肠癌细胞的锚定非依赖性生长和细胞增殖,诱导结肠癌细胞的凋亡。计算机模拟技术显示姜提取物可以同时和LTA4H和AKT竞争性的结合在疏水性的ATP“口袋”从而发挥抑制作用。并且下调结肠癌细胞中LTA4H和AKT的基因,可以抑制结肠癌细胞的增殖和锚定非依赖性生长。第一章姜提取物抑制结肠癌细胞的细胞增殖及锚定非依赖生长方法1.自主研发合成姜提取物。2.细胞毒性试验:检测姜提取物对正常结肠上皮细胞(HCEC)的毒性。3.软琼脂克隆形成实验:研究生姜提取物对结直肠癌细胞不依赖贴壁生长的影响。4.MTS法:检测姜提取物对结肠癌细胞活性的影响。结果1.由老姜中提取出来,能够同时抑制LTA4H和AKT激酶活性的化合物姜提取物2.姜提取物对正常结肠上皮细胞HCEC无明显的毒性作用MTS结果显示:正常结肠上皮细胞(HCEC)在不同浓度梯度的姜提取物加药24h或者48h后,与0μg/ml姜提取物相比较,492nm处吸光度无明显降低,提示姜提取物对HCEC无明显毒性。3.姜提取物可以抑制结肠癌细胞的锚定非依赖性生长软琼脂集落形成实验显示:随着姜提取物浓度的增加,对结肠癌细胞系DLD1和HCT15的克隆形成起到抑制作用。姜提取物浓度为20μg/ml时可以显著抑制了DLD1和HCT15克隆的形成(p0.01),50%以上的克隆被抑制。姜提取物浓度达到40μg/ml时克隆完全被抑制。4.姜提取物能够抑制结肠癌细胞的增殖细胞增殖实验结果显示:随着姜提取物浓度的增加,对结肠癌细胞系DLD1和HCT15的细胞活性能够明显抑制。当浓度达到40μg/ml时,加药72h后,DLD1和HCT15的492nm处吸光度显著降低(p0.01)。第二章姜提取物诱导结肠癌细胞的凋亡和调控结肠癌细胞的周期方法1.流式细胞仪检测姜提取物对结肠癌细胞凋亡的影响。2.流式细胞仪检测姜提取物对结肠癌细胞周期的调控。3.不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞,Western blot检测其对凋亡信号的影响。4.不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞,Western blot检测其对周期信号的影响。结果1.姜提取物诱导结肠癌细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示:不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞72小时后,0μg/ml姜提取物仅能诱导8.5%的细胞凋亡。而用40μg/ml姜提取物处理结肠癌细胞DLD1和HCT15 72小时后,结果显示能够诱导83.68%的细胞凋亡,差异显著(p0.01)。2.姜提取物调控结肠癌细胞周期流式细胞仪检测结果显示:不同浓度的姜提取物处理结肠癌细胞72小时后,姜提取物0μg/ml使细胞阻滞在S期。而随着姜提取物浓度的逐渐增加至40μg/ml处理结肠癌细胞DLD1和HCT15 72小时后,细胞周期阻滞在G1期。3.姜提取物具有诱导结肠癌细胞凋亡功能,并且使凋亡相关蛋白发生改变Western blot检测结果:姜提取物在不同浓度处理结肠癌细胞系DLD1和HCT15细胞72h后,P53,cleaved-PARP,cleaved caspase 3、Bax等促凋亡相关蛋白上调,P-stat3,P-ERK,PARP,Bcl-2等抗细胞凋亡蛋白下调。4.姜提取物能够调控结肠癌细胞的周期,并且引起细胞周期相关信号的改变Western blot检测结果显示,姜提取物在不同浓度处理结肠癌细胞系DLD1和HCT15细胞72小时后,G1相关周期蛋白cyclin D1和cyclin E2下调。第三章LTA4H和AKT在人结直肠癌组织和结肠癌细胞中高表达方法1.Western blot检测LTA4H和AKT在不同的结肠癌细胞系DLD1和HCT15中的表达情况,并且以正常结肠上皮细胞HCEC作为对照。2.在人结肠癌组织中通过免疫组化法检测LTA4H和AKT的表达情况。3.结肠癌细胞在姜提取物处理72h后,用Western blot检测其对LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平的影响。结果1.与正常结肠上皮细胞相比,LTA4H和AKT在结肠癌细胞系中高表达Western blot结果显示:与正常的结肠上皮细胞HCEC相比,LTA4H和AKT在不同的结肠癌细胞系中均呈现高表达状态。2.LTA4H和AKT相对于结肠癌癌旁正常组织,在结肠癌组织中呈高表达状态免疫组化结果显示:LTA4H和AKT相对于结肠癌癌旁正常组织,在人结肠癌组织中呈高表达状态,且差异性显著(p0.01)。3.姜提取物可以抑制LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平,呈浓度依赖性姜提取物以不同浓度处理结肠癌细胞DLD1和HCT15 72小时后,Western blot检测LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3的磷酸化水平。结果显示:姜提取物能够抑制BLT1和P-stat3的磷酸化水平,并且呈现剂量依赖的方式。第四章姜提取物在体外结合并抑制LTA4H和AKT的活性方法1.利用超级计算机技术模拟化合物姜提取物与靶标蛋白LTA4H和AKT的相互作用。2.利用蛋白下拉实验检测姜提取物与LTA4H和AKT在细胞水平的相互作用。结果1.姜提取物与LTA4H或者AKT蛋白的ATP结合区域相结合超级计算机模拟实验证明:姜提取物与LTA4H和AKT的ATP结合口袋存在相互作用,能与这一结构结合形成复合物。2.姜提取物与LTA4H和AKT蛋白在细胞水平结合Pull down实验证明:姜提取物能与LTA4H和AKT相互作用,形成复合物。第五章下调LTA4H和AKT的表达能够抑制结肠癌细胞DLD1的克隆形成和细胞增殖,同时促进结肠癌细胞的凋亡,调控细胞周期。方法1.利用针对LTA4H和AKT的sh RNA,包装出逆转录病毒,感染结肠癌细胞DLD1,从而下调LTA4H和AKT的表达。DLD1细胞被Western Blot检测不同的sh RNA对LTA4H和AKT下调的效果,以β-actin作为上样对照。2.软琼脂集落下调LTA4H和AKT的表达后对结肠癌细胞DLD1克隆形成的影响。3.MTS检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞DLD1增殖能力产生的影响。4.流式细胞仪检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞DLD1的凋亡产生影响。5.流式细胞仪检测结果显示下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞DLD1细胞周期的影响。6.Western Blot检测下调LTA4H和AKT的表达,对结肠癌细胞DLD1产生凋亡相关蛋白,同时能够使LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3磷酸化水平的影响。7.Western Blot检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞DLD1周期相关蛋白的影响。结果1.用sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分别包装的逆转录病毒成功调低结肠癌细胞DLD1中的LTA4H和AKT表达Western Blot结果显示:用shRNA#1(shLTA4H#1+shAKT1#1)和shRNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分别包装的逆转录病毒感染DLD1细胞系,LTA4H和AKT的表达水平与对照组相比明显下降,以β-actin作为上样对照。2.sh RNA#1(sh LTA4H#1+shAKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+shAKT1#793)的DLD1细胞组克隆形成数明显少于shmock DLD1细胞组数目。软琼脂集落实验结果显示:调低LTA4H和AKT的表达后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组能够明显抑制结肠癌细胞DLD1的非依赖性生长,跟shmock细胞组相比,克隆数目明显减少(p0.01)。3.调低LTA4H和AKT的表达水平,能够明显抑制结肠癌细胞的增殖能力MTS结果显示:下调LTA4H和AKT的表达后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组能够显著抑制结肠癌DLD1的增殖(p0.01)。4.调低LTA4H和AKT的表达水平,能够显著促使结肠癌细胞的凋亡流式细胞仪检测结果显示:下调LTA4H和AKT的表达水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组能够引起DLD1细胞系18%和10%的细胞凋亡,从而促使sh Mock的细胞凋亡只有1%(p0.01)。5下调LTA4H和AKT的表达水平,能够显著调控结肠癌细胞的存活周期流式细胞仪检测结果:下调LTA4H和AKT的表达水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)处理结肠癌细胞DLD172小时后,细胞阻滞在G1期。而sh Mock处理过的细胞阻滞在S期。6.下调LTA4H和AKT的表达水平,加速P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、Bax等凋亡相关蛋白的表达水平,能明显抑制LTA4H下游信号分子BLT1和AKT下游信号分子P-stat3的磷酸化水平Western Blot结果:与sh Mock细胞组相比,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组分别在DLD1细胞系中明显加速了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、BAX等促凋亡相关蛋白的表达水平。同时,下调LTA4H和AKT的表达水平后,明显抑制了LTA4H下游信号分子BLT1和AKT下游信号分子P-stat3的磷酸化水平。7.下调LTA4H和AKT的表达水平,引起细胞周期相关信号的改变Western blot检测结果显示,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组处理结肠癌细胞DLD1细胞72小时后,下调G1相关周期蛋白cyclin D1和cyclin E2。第六章下调LTA4H和AKT的表达能够抑制结肠癌细胞HCT15的克隆形成和细胞增殖,同时促进结肠癌细胞的凋亡,调控细胞周期。方法1.利用针对LTA4H和AKT的shRNA,分离出逆转录病毒,促使感染结肠癌细胞HCT15,进一步影响下调LTA4H和AKT的表达。Western Blot检测不同的sh RNA对LTA4H和AKT调低的效果,以β-actin作为上样对照。2.软琼脂集落形成实验检测下调LTA4H和AKT的表达后对结肠癌细胞HCT15克隆形成的影响。3.MTS检测下调LTA4H和AKT的表达后,能够对结肠癌细胞HCT15增殖能力的影响。4.流式细胞仪检测下调LTA4H和AKT的表达后,能够对结肠癌细胞HCT15凋亡的影响。5.流式细胞仪检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞HCT15周期的影响。6.Western Blot检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞HCT15凋亡相关蛋白以及LTA4H下游BLT1和AKT下游P-stat3磷酸化水平的影响。7.Western Blot检测下调LTA4H和AKT的表达后,对结肠癌细胞HCT15周期相关蛋白的影响。结果1.用sh RNA#1(sh LTA4H#1+shAKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分别包装的逆转录病毒成功调低结肠癌细胞HCT15中的LTA4H和AKT表达。Western Blot结果显示:用sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)分别包装的逆转录病毒感染HCT15细胞系,LTA4H和AKT的表达水平与对照组相比明显下降,以β-actin作为上样对照。2.sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)的HCT15细胞组克隆形成数明显少于shmock HCT15细胞组软琼脂集落形成实验结果:下调LTA4H和AKT的表达后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组能够显著抑制结肠癌细胞HCT15的锚定非依赖性生长,跟shmock细胞组相比,克隆数目明显减少(p0.01)。3.下调LTA4H和AKT的表达水平,能够显著抑制结肠癌细胞的增殖能力MTS结果显示:下调LTA4H和AKT的表达后,shRNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组能够显著抑制结肠癌HCT15的增殖(p0.01)。4.下调LTA4H和AKT的表达水平,能够显著加速结肠癌细胞HCT15的凋亡流式细胞仪检测结果显示:下调LTA4H和AKT的表达水平后,;sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组分别能够引起HCT15细胞系9%和12%的细胞凋亡,而引起sh Mock的细胞凋亡只有2%(p0.01)。5.下调LTA4H和AKT的表达水平,能够明显调控结肠癌细胞的周期流式细胞仪检测结果显示:下调LTA4H和AKT的表达水平后,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组处理结直肠癌细胞HCT15 72小时后,细胞阻滞在G1期。而sh Mock处理过的细胞阻滞在S期。6.下调LTA4H和AKT的表达水平,明显增加了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、Bax等凋亡相关蛋白的表达水平,同时显著抑制了LTA4H下游信号分子BLT1和AKT下游信号蛋白P-stat3的磷酸化水平Western Blot结果显示:与sh Mock细胞组相比,sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组分别HCT15细胞系中明显增加了P53、cleaved PARP、cleaved caspase3、BAX等促凋亡相关蛋白的表达水平。同时调低LTA4H和HCT15的表达水平后,显著抑制了LTA4H下游信号分子BLT1和AKT下游信号分子P-stat3的磷酸化水平。7.下调LTA4H和AKT的表达水平,引起细胞周期相关信号的改变Western blot检测结果:sh RNA#1(sh LTA4H#1+sh AKT1#1)和sh RNA#2(sh LTA4H#2+sh AKT1#793)细胞组处理结直肠癌细胞HCT15细胞72小时后,下调G1相关周期蛋白cyclin D1和cyclin E2。结论1.姜提取物作为本实验室提取的一种混合物,通过计算机模拟、体外水平及细胞水平的研究结果证实:姜提取物直接作用于LTA4H和AKT的ATP结合区域上,与LTA4H和AKT结合,通过ATP竞争抑制的方式使结合区域失活,从而达到抑制其下游信号转导通路,起到抑制结肠癌细胞的生长和增殖的作用。2.从分子水平与细胞水平实验结果我们可以看到,两者结论相一致。姜提取物能够有效抑制结肠癌细胞的生长和增殖,且无明显毒副作用。这为结肠癌的分子靶向治疗提供了新的治疗选择。
【图文】：

提取物,化学结构式,效率差异,对正

图 1-1 姜提取物化学结构式ig. 1-1 Chemical structure of Ginger Extr结肠上皮细胞 HCEC 没有毒提取物对正常结肠上皮细胞 HCESO 作为对照。结果显示：姜提取对照组相比，其增殖效率差异不显g/ml 或者低于 40μg/ml 时对 HCEC

提取物,细胞毒性,结肠癌细胞

图 1-2 MTS 检测姜提取物对 HCEC 的细胞毒性。以 DMSO 作为对照组，不同浓度的姜提取物加药 HCEC 细胞 24 小时或者 48 小时。统计学数据使用均数±标准差表示。Fig. 1-2 MTS detects the cytotoxicity of ginger extract on HCEC. DMSO was used as a controlgroup, and different concentrations of ginger extract were added to HCEC cells for 24 hours or 48hours. Statistical data were expressed using mean ± standard deviation.2.3 姜提取物能够抑制结肠癌细胞的锚定非依赖性生长通过软琼脂集落形成实验，我们来检测姜提取物对结肠癌细胞 DLD1 和HCT15 的抑制作用。实验表明：姜提取物能够明显抑制结肠癌细胞 DLD1 和HCT15 的克隆形成，且呈浓度依赖性（图 1-3）。相对于对照组（ DMSO），，当姜提取物 20μg/ml 时，可以显著抑制 DLD1 和 HCT15 克隆形成（p<0.01），姜提取物 40μg/ml 时，可以使 DLD1 和 HCT15 克隆完全消失（p<0.01）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】