【摘要】：香菇为担子菌纲伞形科真菌,又称香覃、摧茸、花菇,是全球第二大人工种植的药食同源菌,其味道鲜美,营养极其丰富,已被视为“菇中之王”。中医理论认为香菇具有益气健脾,扶正祛邪,益寿延年的效果(如《本草纲目》记载香菇“性甘、味平、无毒,益气不饥,治风破血,益味助食,理小便不禁”;《医林纂要》中记载香菇“可托豆毒”;《本经逢原》中记载香菇“大益胃气”)。现代医学研究表明,香菇中含多种药理活性良好的药用成分,其中最主要活性成分即为香菇多糖(LNT)。香菇多糖注射剂在临床已广泛用于肿瘤的辅助治疗,且已证实有明显的疗效;而香菇多糖口服制剂,如香菇多糖片和香菇多糖胶囊,目前也已开始在临床用于消化道肿瘤辅助治疗和免疫调节。作为保健品,香菇多糖口服制剂更是普及至欧美。目前,香菇多糖的各种药理活性还在被不断开发中,比如已经证实其在抗糖尿病、抗疲劳、防辐射、防结肠炎等方面均有显著疗效。但是,LNT的药代动力学信息却鲜有报道,这严重限制了LNT作为药品在临床的进一步推广和安全使用。因此,本课题沿用实验室前期确定的提取方法上,改进纯化工艺,从房县小香菇中提取纯化制备LNT;采用核素标记和荧光标记对LNT的体内过程进行示踪,系统研究LNT口服和静脉给药后的药物动力学;采用Ussing Chamber和Caco-2细胞单层模型研究LNT的肠道吸收机制;采用体外肝微粒体孵育法研究LNT的肝脏代谢降解机制,旨在系统深入地探明LNT的药物代谢和药物动力学。第一部分香菇多糖LNT的制备采用水提醇沉法从房县小香菇中得到香菇粗多糖,经H2O2脱色、超滤、中压制备柱分离、冷冻干燥最终得到水溶性精制LNT。苯酚-硫酸法测定其糖含量为97.8±2.9%;高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)和体积排阻色谱法(SEC)测定其分子量段为400-500 kDa;紫外扫描显示LNT几乎不含核酸和蛋白质。结果表明本实验提取纯化的LNT纯度高,分子量均一性好,适合进行后续实验。第二部分香菇多糖LNT的标记及其在生物样本中定性定置检测方法的建立选用临床常用核素锝标记LNT,由于LNT不能直接螯合核素,故本研究采用螯合剂DTPA连接在LNT上作为中间体(D-LNT),然后螯合核素锝,得到香菇多糖锝标记物(99mTc-LNT)。红外光谱分析显示,D-LNT与LNT的红外图谱进行对比,在1734cm-1处有一明显的吸收峰;元素分析结果显示D-LNT中的N含量,由最初的0.05%升至0.57%,表明D-LNT衍生物制备成功。PD-10柱纯化过程中的流出曲线结果显示,糖含量流出曲线与γ计数流出曲线吻合良好;ITLC-SG层析法结果显示,Na99mTc04和99mTc-LNT的Rf值分别为0.70和0.09,表明本研究99mTc-LNT合成成功。D-LNT和LNT的HPGPC图谱的色谱峰其出峰时间和峰形基本一致,表明标记工艺对LNT的分子量大小和分布没有明显影响;刚果红实验结果显示,D-LNT仍保持LNT的三螺旋结构。考察99mTc-LNT的稳定性,在生物样品中的检测下限(即灵敏度)、精密度、特异性和整体回收率。结果显示,37℃下,99mTc-LNT在PBS和血清中24h后标记率分别为92.25%和91.28%,稳定性良好;检测下限可以达到4 ng/mL;生物样品中低、中、高三种浓度99mTc-LNT的24 h精密度RSD分别在6.12%、4.22%和3.66%以内,精密度良好;静脉给药后,Na99mTc04主要分布在胃,而99mTc-LNT主要分布在肝脏和脾脏,表明99mTc-LNT在生物样品中检测特异性良好;99mTc-LNT进入体内后,最终能检测到的总量大于90%,回收率满足实验要求。旨在建立了一套LNT在生物样品中定量检测的方法。采用水溶性荧光素5-DTAF,在pH=9.5的碳酸盐缓冲液中,分别在25℃和4℃条件下反应,透析,Sephadex G-50凝胶柱分离纯化得到香菇多糖荧光标记物(FLNT)。通过红外光谱分析、元素分析、紫外光谱扫描、荧光光谱扫描以及HPGPC荧光检测,共同证明FLNT标记的成功。同样HPGPC示差检测结果和刚果红实验结果证实荧光标记工艺对LNT的分子量和空间结构均无明显影响。考察生物样品除蛋白条件和37℃孵育条件对FLNT色谱峰的影响,证实FLNT在生物样品中荧光色谱峰的特异性,建立LNT在生物样品中定性检测的方法。本部分实验,结合放射性标记和荧光标记的优势,建立LNT在生物样本中定性定量的检测方法,为LNT体内药代动力学的研究奠定基础。第三部分香菇多糖LNT口服给药后的药物动力学在建立99mTc-LNT生物样品中定量检测方法的基础上,本部分实验采用99mTc-LNT灌胃给药,探索LNT 口服给药后的血药浓度、组织分布和排泄。结果表明,LNT口服后有明显的吸收,且在1h时达到最大血药浓度,在8h时,仍能在血液中明显检测到LNT;在各组织中均有一定分布,其中在与口服吸收相关的胃肠道组织分布最多,其次是肝脏;99mTc-LNT灌胃后主要随粪便排泄,但是仍然有明显的一部分随尿液排泄。第四部分香菇多糖LNT 口服吸收机制研究第三部分证实LNT 口服可以吸收,为探索其吸收机制,本部分采用Ussing Chamber技术和Caco-2细胞单层模型证实LNT的肠道吸收。Ussing Chamber结果显示LNT在各肠道吸收明显,十二指肠,空肠,回肠和结肠中FLNT的Papp值分别为 1.08×10-6cm/s,1.62×10-6cm/s,4.06×10-6cm/s和0.70×10-6cm/s,回肠是LNT吸收的优势肠段。激光共聚焦观察Caco-2细胞对FLNT的摄取,证实Caco-2细胞对FLNT的摄取明显,且在胞质中均匀分布。流式细胞仪半定量分析Caco-2细胞对FLNT的摄取量,对FLNT的跨膜转运机制进行研究。(1)在FLNT的摄取实验中,发现NaN3和低温环境(4℃)可以抑制Caco-2细胞对FLNT的摄取;(2)细胞内吞抑制剂中 Chloropromazine、Dynasore、Ly294002和Cytochalasin D均能显著抑制Caco-2细胞对FLNT的摄取,而Genistein和β-CD对FLNT的摄取没有影响;(3)细胞内转运抑制剂Bafilomycin A1和Thapsigargin显著抑制Caco-2细胞对FLNT 的摄取,而Chloroquine、Vinblastine和Monensin对FLNT 的摄取没有影响。(4)在FLNT的出胞实验中,发现Bafilomycin A1和Vinblastine对FLNT的出胞具有显著抑制作用,而Chloroquine、Thapsigargin和Monensin对FLNT的出胞运动没有影响。采用Transwell小室构建Caco-2细胞单层模型,通过加入各种内吞途径抑制剂来考察FLNT在上皮细胞单层中的转运机制。结果显示,加入Dynasore、Chloropromazine、Ly294002和Cytochalasin D后,跨膜转运率分别减少了26.89%、16.83%、22.30%和34.65%。而加入Genistein和β-CD后,跨膜转运率没有明显变化。该结果与流式细胞仪检测Caco-2细胞摄取FLNT的结果基本一致。通过本部分研究结果证实,FLNT可以通过网格蛋白介导和巨胞饮途径内吞进入细胞,从而进行跨膜转运,这可能是LNT 口服吸收的机制之一。第五部分香菇多糖LNT静脉给药后的药物动力学研究在99mTc-LNT生物样品中定量检测方法的基础上,本部分实验结合SPECT/CT活体成像,系统研究LNT静脉给药后的药物动力学特征。血药浓度结果显示,99mTc-LNT经静脉给药后,在体内呈双相消除,且在0.5-8 mg/kg剂量范围内,LNT的剂量对其静脉给药后的药物动力学特征没有影响。体内分布结果表明,99mTc-LNT经静脉给药后,迅速在肝脏聚集,其次是脾脏。排泄结果显示,99mTc-LNT经静脉给药后,主要经肾随尿液排泄,但是粪便排泄也占有一定的比例。SPECT/CT成像结果证实,99mTc-LNT信号最强的部位为肝脏,至4h时γ信号依然很强。SPECT动态显像直观呈现99mTc-LNT静脉给药后机体1 h内的实时动态变化,其变化趋势与前面血药浓度、体内分布和排泄的研究结果一致。第六部分香菇多糖LNT肝脏降解代谢的机制研究采用肝微粒体孵育法研究LNT肝脏代谢降解机制。在FLNT生物样品中定性检测方法的基础上,优化FLNT与肝微粒体孵育的最佳条件。以H2/H1(降解峰强度/原形峰强度)比值作为降解参数,来判断FLNT的降解程度。分别以α-萘黄酮、奎尼丁、酮康唑、磺胺甲恶唑、二乙基二硫代氨基甲酸钠、毛果芸香碱为CYP 1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP2A6的特异性抑制剂,丙戊酰胺为环氧化物水解酶抑制剂,探索CYP酶系不同亚型和环氧化物水解酶对LNT降解的影响。结果显示,CYP2D和CYP2C两种亚型,以及环氧化物水解酶参与了肝脏LNT的代谢降解。
【图文】：
用 2-3 个柱体积流动相（子香菇多糖，充分溶解于 0.1 M NaNO。待上样完毕，样品全部进入填料后，将下端连接示差折光检测器。NO3溶液为流动相，流速为 1.0 mL/min示差折光检测器的流出曲线图，合并分制香菇多糖，命名 LNT。粗多糖粉末呈棕黄色，水溶性良好，，不同续分离纯化。
图 1-2 脱色后香菇多糖Fig. 1-2 Decolorization of crude polysaccharide图 1-3 超滤液糖含量变化图ig. 1-3 The picture of ultra-filtrate sugar content cha
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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本文编号：
2675014
