【摘要】：目的:观察乳岩宁联合依西美坦对绝经后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠瘤重和抑瘤率,探讨乳岩宁抑制肿瘤细胞生长的机制;探究乳岩宁联合依西美坦通过PI3K-AKT通路绝经后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠作用机制;观察中药复方乳岩宁联合依西美坦对绝经后MDA-MB-435乳腺癌荷瘤裸鼠m-TOR,HIF-1,LDH-A等蛋白的表达,探究其代谢的调控机制。材料与方法:1.材料:细胞株:人乳腺癌MDA-MB-435细胞株实验动物:雌性BALB/C无胸腺裸鼠50只(SPF级),4~6周龄,体重20±2g中药的制备:乳岩宁方(方中包括柴胡10g,太子参15g、黄芩15g、法半夏10g、炙甘草10g,生龙骨、生牡蛎各30g等11味中药)购自于辽宁中医药大学附属医院,分别加入10倍及8倍的纯净水,分别煎煮60分钟和40分钟,将两份药液合并,弃去药渣,调整浓度至3.3 g/ml,4℃冰箱保存备用。依西美坦:25mg/片,溶解于蒸馏水中,调整浓度至3mg/ml备用。2.双侧卵巢切除(去势)模型的制备:取浓度为100mg/ml的10%水合氯醛,以4ml/kg的比重,以腹腔注射法向裸鼠体内注入以麻醉裸鼠。将裸鼠俯卧于洁净的手术台上,四肢固定于手术台中央,用备皮器在背部正中(肋弓下缘处)备皮,使用络合碘消毒,用手术刀轻轻地切开皮肤,切口处位于脊柱旁0.5cm,距肋弓下缘0.5cm处。顺次用刀切开肌肉,用剪刀剪开腹膜。腹腔内可见乳白色组织。然后将之轻轻地提出腹腔,被腹膜包裹的米粒大小粉红色的“桑椹样”的卵巢可以被看见。然后用钳子钳夹并结扎,分离出卵巢,分离后检查腹腔内有无渗血,用缝合器分层缝合皮肤,用络合碘为切口消毒。利用上述方法切除对侧卵巢,将小鼠保温在20℃左右环境中,等待麻醉后苏醒。术后肌肉注射青霉素(6万U/ml)抗炎,0.25ml/日,并用碘伏消毒切口,连续3天。自由进食水。用标准SPF饲料,饲养30天,造模成功。3.MDA-MB-435细胞株乳腺癌荷瘤裸鼠移植模型的建立:用胰酶/EDTA将对数生长期的MDA-MB-435细胞消化后,PBS液清洗2次,细胞内加入适量的细胞培养液,然后将其吹打均匀。用0.4%台盼蓝将细胞染色,记录活细胞数(95%),细胞计数板计数,并使活细胞浓度调整为1×10~7/ml。取去势后的裸鼠,在其右侧胸壁利用碘伏进行消毒,利用注射器(1ml)在2只裸鼠的右侧胸壁的第二乳垫处接种细胞液,细胞液浓度0.2ml/只。10天左右,可见接种部位乳垫处的肿瘤结节,其质地较硬,越来越大,长势迅速。当原代肿瘤长至0.8cm~3大小,利用手术的方式取下肿瘤。骨髓穿刺针将原代肿瘤移植至余48只裸鼠乳垫下:取10%水合氯醛(0.02ml/10g体重)以腹腔注射法向裸鼠体内注入以麻醉裸鼠,在无菌的条件下取原代肿瘤组织并立即放入DMEM培养液中,用剪刀将其剪切成1mm~3左右的小块,并将小块置入骨髓穿刺针中备用。接种前,先在裸鼠的右侧胸壁用碘伏进行消毒处理,于右侧胸壁第二乳垫旁开1cm处平刺进针,当针进入到乳垫下的时候,将针芯插入进去。瘤组织随即便留在右侧胸壁的第二乳垫下,然后用碘酒将皮肤消毒,不需要缝合伤口,一次性腹腔注射青霉素注射液1.5万U,将裸鼠继续饲养于SPF级箱中。移植后的第四至五天后右侧胸壁的第二乳垫处可见到有实体肿瘤的生长,成瘤率100%,而且形状、大小较整齐,在移植后第十五天左右肿瘤可长至9±2mm。4.实验分组及给药:取造模成功的50只的裸鼠中瘤体长势良好的48只并随机分为四组:空白模型对照组,中药组(乳岩宁组),西药组(依西美坦组),联合组(乳岩宁+依西美坦组)。根据人和鼠给药剂量换算公式,计算各组给药的剂量。(1)空白模型对照组:0.2ml/只/天生理盐水灌胃(2)中药组(乳岩宁组):乳岩宁药液,以33.3g/kg体重给药(相当于临床人用量的12倍),0.2ml/只/天灌胃(3)西药组(依西美坦组):依西美坦按4mg/kg体重给药(相当于临床人用量的10倍),0.2ml/只/天灌胃(4)结合组(乳岩宁+依西美坦),乳岩宁33.3g/kg体重+依西美坦4mg/kg体重,0.2ml/只/天灌胃,连续给药21天。5.实验取材实验结束,各组裸鼠分别进行取材,用脱颈处死法将裸鼠处死,并置于冰盒之上。将小鼠胸部肿瘤完整的剥离下来,称取重量并放置在冰盒之上。肉眼观察瘤体组织形态、大小,之后将其切取成若干肿瘤全层组织,同时注意多点取材以避免肿瘤坏死组织,共取材2份:(1)RT-PCR标本:2-3个大小约8 mm~3组织块,置于1mlTrizol中,记号笔标记后,立即置于-80℃冰箱中冻存备用;(2)Western Blot标本:组织块置于EP管中,-80℃冰箱中冻存备用;6.检测指标:(1)21天后,利用脱颈处死法处死裸鼠后,完整剥离肿瘤称重,计算抑瘤率,抑瘤率公式:抑瘤率=(模型组瘤重一实验组瘤重)/模型组瘤重×100%;(2)抑癌作用:Western blot蛋白免疫印迹法检测瘤体中P53、caspase3的表达,RT-PCR法检测瘤体中NF-kB,并对结果进行统计分析。(3)PI3K-AKT通路:Western blot蛋白免疫印迹法检测瘤体中PI3K、AKT的表达,RT-PCR法检测瘤体中PI3K、AKT的表达,并对结果进行统计分析。(4)代谢调控机制:Western blot蛋白免疫印迹法检测瘤体中mTOR和HIF-1表达,RT-PCR法检测瘤体中mTOR、LDH-A、HIF-1和GLUT1的表达,并对结果进行统计分析。结果:1.瘤重:与对照组比较,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的瘤体质量明显降低(P0.05),其中联合组(乳岩宁+依西美坦组)较中药组(乳岩宁组)和西药组(依西美坦组)的瘤重有明显降低(P0.05)。2.抑癌作用:Western blot:P53和caspase3:与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的蛋白表达明显上升(P0.05),联合组(乳岩宁+依西美坦组)较中药组(乳岩宁组)和西药组(依西美坦组)有明显升高(P0.05);RT-PCR:NF-kB基因:与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的NF-kB基因表达明显下降(P0.05),联合组(乳岩宁+依西美坦组)的趋势更加明显(P0.05)。3.PI3K-AKT通路:Western blot:PI3K、AKT的蛋白表达:与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的PI3K、AKT的蛋白表达均明显下降(P0.05)。联合组(乳岩宁+依西美坦组)的PI3K和AKT的蛋白表达较中药组(乳岩宁组)和西药组(依西美坦组)有明显下降(P0.05)。RT-PCR:PI3K、AKT基因表达:与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的PI3K、AKT基因表达均明显降低(P0.05),联合组(乳岩宁+依西美坦组)的趋势更加明显(P0.05)。4.代谢调控机制:Western blot:mTOR、HIF-1蛋白表达,与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的mTOR、HIF-1和GLUT1蛋白表达均明显降低(P0.05),联合组(乳岩宁+依西美坦组)的趋势更加明显(P0.05);mTOR、LDH-A、HIF-1和GLUT1基因表达:与对照组相比,中药组(乳岩宁组)、西药组(依西美坦组)和联合组(乳岩宁+依西美坦组)的mTOR、LDH、HIF和GLUT1基因表达均明显降低(P0.05)。联合组(乳岩宁+依西美坦组)的各基因表达较中药组(乳岩宁组)和西药组(依西美坦组)有明显下降,(P0.05)。结论:1.乳岩宁联合依西美坦对绝经后乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用:乳岩宁和依西美坦可通过上调P53和caspase3蛋白、下调NF-kB基因的表达对绝经后乳腺癌荷瘤裸鼠瘤体均有明显的抑制作用,且联合用药作用更加明显。2.乳岩宁联合依西美坦对绝经后乳腺癌荷瘤裸鼠PI3K-AKT通路的影响:乳岩宁联合依西美坦可通过下调PI3K、AKT的蛋白和基因的表达以抑制PI3K-AKT通路的活性。3.乳岩宁联合依西美坦对绝经后乳腺癌荷瘤裸鼠代谢调控机制:乳岩宁联合依西美坦可通过下调PI3K-AKT通路下游基因的表达以影响肿瘤细胞代谢活动,以抑制肿瘤细胞生长。
【图文】：
萎靡、活动次数减少，，中药组（乳岩宁组）上述表现较少。期组）和西药组（依西美坦组）各有一只裸鼠因肿瘤消耗死实验结束未有裸鼠死亡。表 2 各组裸鼠瘤重比较（x±s）Table 2 Change in tumor weight of micen Body weight（g） Tumor weight（g） Tumo12 20.33±1.37 1.090±0.904* －12 20.67±0.65 0.667±0.236** 38.8011 20.45±1.29 0.675±0.202# 38.0711 20.63±1.43 0.251±0.098 76.97control vs others ** p>0.05 Ruyanning vs Exemestane group , # Exemestane vs combined
图 3.各组 P53 和 caspase3 蛋白的相对表达量Fig3. The relative expression of P53 and caspase3 for all groups* P<0.05 control vs others ,#P<0.05 Ruyanning and Exemestane vs com3 所示：与对照组相比，中药组（乳岩宁组）、西药组（依西美坦组宁+依西美坦组）的 P53、caspase3 的表达明显升高，有统计学意义（组（乳岩宁+依西美坦组）较中药组（乳岩宁组）和西药组（依西美显降低，有统计学意义（#P<0.05）。说明乳岩宁和依西美坦均可上的蛋白表达，且联合应用优势更加明显。R 法检测 NF-kB 基因表达
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 李军,郭瑞臣,王本杰;依西美坦胶囊的人体生物等效性研究[J];中国药房;2003年10期
2 高磊,闫占军,王伟,张丽华;依西美坦胶囊溶出度测定[J];中国药品标准;2002年02期
3 邵颖,黎文海,尤启冬;依西美坦的合成[J];中国医药工业杂志;2001年08期
4 赵修南;依西美坦治疗绝经后妇女晚期乳腺癌[J];国外医学.药学分册;2000年03期
5 赵勇;P&U公司的依西美坦在美国获准上市[J];国外医学.药学分册;2000年03期
6 ;激素敏感性早期乳腺癌:依西美坦初始不优于序贯[J];现代医院;2010年02期
7 ;依西美坦对绝经后妇女乳腺癌的预防作用[J];生殖医学杂志;2012年04期
8 ;依西美坦对绝经后妇女乳腺癌的预防作用[J];中国计划生育学杂志;2012年12期
9 崔宇;姚嫱;;依西美坦在乳腺癌治疗中的应用[J];天津药学;2006年06期
10 刘晓晴,宋三泰,刘基巍,任军,汪安兰,樊青霞,王雅杰,宋恕平,谢广茹,秦凤展,王天峰;依西美坦治疗绝经后晚期乳腺癌的临床研究[J];中华肿瘤杂志;2003年05期
相关会议论文 前3条
1 王绍光;李继俊;赵兴波;李建峰;;芳香化酶抑制剂依西美坦对异位子宫内膜间质细胞caspase-3表达的影响[A];第八次全国妇产科学学术会议论文汇编[C];2004年
2 于世英;;2011年临床肿瘤学进展[A];第22届湖北省肿瘤学术大会论文汇编[C];2012年
3 王晓稼;;从MA27研究看个体化辅助内分泌治疗[A];首届浙赣两省肿瘤研究交流会论文汇编[C];2012年
相关重要报纸文章 前5条
1 唐风;FDA批准依西美坦用于乳癌辅助治疗[N];中国医药报;2005年
2 张骁；束梅英;新型芳香化酶抑制剂依西美坦[N];中国医药报;2004年
3 本文由香港麦迪信医学出版有限公司供稿;抗肿瘤药物研究未来谁领风骚[N];医药经济报;2003年
4 编译 伊遥;第三代芳香化酶抑制剂优势明显[N];中国医药报;2012年
5 伊遥;SERMs疲软，AIs赶超[N];医药经济报;2012年
相关博士学位论文 前2条
1 程思谟;乳岩宁联合依西美坦通过Pi3K-Akt通路对乳腺癌荷瘤裸鼠代谢机制的研究[D];辽宁中医药大学;2018年
2 邢延一;非甾体类芳香化酶抑制剂的代谢研究及其专属性指标模型的建立[D];北京中医药大学;2016年
相关硕士学位论文 前10条
1 张旭;芳香化酶抑制剂影响绝经后激素受体阳性乳腺癌患者血脂水平的研究[D];遵义医学院;2018年
2 徐慧婷;依西美坦的合成新工艺及其螺环衍生物的研究[D];绍兴文理学院;2018年
3 马文心;疏肝益肾方联合依西美坦治疗ctDNA内分泌耐药基因突变晚期乳腺癌研究[D];北京中医药大学;2018年
4 李皓;乳岩宁配合依西美坦对乳腺癌裸鼠GLUT1和PKM2表达的影响[D];辽宁中医药大学;2017年
5 李光;生物转化法制备依西美坦的研究[D];湖南师范大学;2009年
6 杨雅岚;ESR1基因突变与乳腺癌内分泌治疗耐药的相关性[D];北京协和医学院;2017年
7 马丹;疏肝益肾方治疗乳腺癌一线AIs失败后的临床研究[D];中国中医科学院;2015年
8 谭桂兰;补肾法对应用芳香化酶抑制剂的肾虚型乳腺癌患者的影响[D];广州中医药大学;2014年
9 陈茂伟;生物降解型聚谷氨酸乙酯微球的研究[D];南京工业大学;2003年
10 恩阳;系统评价芳香酶抑制剂对一线治疗早期乳腺癌的网络meta分析[D];广西医科大学;2015年
本文编号：
2675977
