蓓蕾蓝靛果花色苷分离纯化及抗肿瘤作用研究

发布时间：2020-05-22 18:32

【摘要】：蓓蕾蓝靛果(Lonicera caerulea 'Beilei')是我国审定的第一个蓝靛果品种,也是目前东北地区主要栽培品种,栽培面积逐年增加,但是其果实加工利用、生理功能等基础理论和技术方面研究相对滞后,制约了其产业的发展速度和水平。蓓蕾蓝靛果富含花色苷类物质,该类物质已被证实具有抗细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等功能。近年来,从植物源中分离提取花色苷类物质,研究其生理活性并加以利用,已成为植物资源开发利用领域研究的热点。本论文以蓓蕾蓝靛果为材料,开展其花色苷的分离提取及抗肿瘤活性研究。采用响应面法优化超声辅助逆流提取蓓蕾蓝靛果花色苷工艺参数,通过介质筛选,研究蓓蕾蓝靛果花色苷分离纯化方法,并从体外细胞、体内动物模型两个层面系统研究蓓蕾花色苷的抗肿瘤效果和相关机制。研究结果可为蓓蕾蓝靛果资源的深入开发利用提供理论基础和技术参考。主要研究结果如下:(1)建立了蓓蕾蓝靛果花色苷的超声逆流提取工艺,最佳工艺参数为:三级逆流提取,溶剂为70%(v/v)乙醇水溶液,固-液比1:10(g/ml),超声时间28min,超声温度30℃,超声功率120W,蓓蕾花色苷得率为5.22%。在最佳工艺条件下,与超声波法比较(89.86%),该工艺提取率提高了 10%。(2)从静态吸附、静态解析和动态流动洗脱三个方面比较不同分离介质的分离纯化效果,筛选出了适宜于蓝靛果花色苷分离制备的新型树脂XDA-6。采用该树脂分离纯化蓓蕾蓝靛果花色苷,得到纯度20%以上的花色苷组分4个:B1(25.35±0.23%)、B2(42.91 ±0.32%)、B3(31.12±0.32%)、B4(24.87±0.26%),其中 B2 组分(纯度为42.91 ±0.32%)与以往采用X-5树脂制备的蓝靛果花色苷(纯度为34.85%)比较,纯度提高了 8.06%。(3)四个蓓蕾花色苷组分(B1-B4,纯度高于20%的)抗SMMC-7721细胞增殖效果最佳,且对正常细胞293T无细胞毒性,但它们抗MCF-7细胞增殖作用不明显;四个分离组分中,B2组分抗SMMC-7221细胞增殖效果最好(IC50值为0.123mg/mL)。根据流式细胞术,荧光显色和电镜观测结果,蓓蕾花色苷B2组分不但具有抗SMMC-7721细胞增殖活性,而且具有诱导SMMC-7721细胞凋亡(细胞凋亡率为66.32±1.05%)的作用,其作用机制是:B2组分可以把细胞周期阻滞在G2/M期,DNA受到损伤,减少有丝分裂,从而导致细胞凋亡。(4)蓓蕾花色苷B2组分各剂量组对H22荷瘤小鼠均有抗肿瘤作用,其中高剂量组的抗肿瘤作用最佳,抑瘤率达到46.30±2.20%,而且可以明显改善H22荷瘤小鼠的生存状态和免疫器官机能。其抗肿瘤活性机制:通过提高小鼠机体内SOD、GSH-Px的酶活,降低脂质过氧化水平,提高抗氧化能力;通过调节免疫细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平,尤其是肝脏中IL-2和TNF-α的水平,提高免疫活性,直接杀伤肿瘤细胞。(5)抗肿瘤活性最强的蓓蕾花色苷组分B2的主要花色苷类型为矢车菊-3-葡萄糖苷,其含量为42.91±0.32%。
【图文】：

示意图,逆流提取,四级,原理

图２－１四级逆流提取原理示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｆｏｕｒ－ｓｔａｇｅ邋ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑

蓝靛果,花色苷,提取温度,液比

逡逑由图２－３多重比较结果可见，固－液比为１：．５时，提取效率最低，与其他组存在显著逡逑性差异（ＰＣ０．０５），这是因为溶液体积少，很容易达到饱和，使目标产物花色苷不能逡逑充分溶出，固－液比从１：１０增加到１：３０时，随着溶剂量的增加，蓓蕾蓝靛果花色苷的得逡逑率逐渐增大，固－液比由１：１０增加到１：１５时，两者之间没有显著性（Ｐ＞０．０５）差异，花逡逑色苷的得率仅增加了邋２．５０％，从经济成本及后续浓缩处理等角度考虑，确定固－液比单因逡逑素的条件为１：１０。逡逑２．４．１．３提取温度对蓓蕾蓝靛果花色苷得率的影响逡逑一般情况下，物质＆是随着温度的升高溶解度升高。天然产物的提取，，根据目标产逡逑物和提取溶剂的性质不同，其提取所需要的温度也不同。提取温度对花色苷得率的影响逡逑方差分析结果见表２－１，多重比较结果见图２－４。逡逑４．５「邋ｅ逡逑ｄ逦ｄ逡逑＾邋４．０逦－逡逑％逦N逦ｂ逡逑Ｅ邋３．Ｓ逦－逦ｒ－．－：
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285

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