氯化两面针碱阻断Top I抑制剂诱导的DNA损伤修复的作用及机制研究

发布时间：2020-05-25 05:23

【摘要】：目的:1、研究NC和SN38对HT29细胞增殖的协同抑制作用,NC阻断SN38诱导的DNA损伤修复和引起DNA损伤。2、探讨NC阻断DNA损伤修复的分子机制。3、评价NC对HT29细胞增殖和凋亡的影响。方法:1、以人结直肠癌HT29细胞作为受试对象,通过NC和SN38联合用药,采用MTT和流式细胞实验检测细胞的增殖和凋亡变化,评价不同浓度的NC和SN38对HT29细胞增殖的协同抑制作用。2、采用彗星实验检测NC和SN38对HT29细胞DNA损伤和修复情况,western blotting和免疫荧光实验检测细胞p-H2AX的蛋白表达。3、以western blotting实验检测Eme1、p-Src(Tyr419)、Stat3、p-Stat3(Tyr705)、p-Stat3(Ser727)蛋白的表达,深入探讨NC引起DNA损伤和阻断SN38诱导的DNA损伤修复的分子机制。4、以慢病毒载体成功建立稳定过表达Eme1的HT29细胞系,采用彗星实验检测NC和SN38对细胞DNA损伤和修复情况,western blotting实验检测NC对Eme1蛋白表达影响。5、以CCK8和流式细胞实验评价不同浓度的NC对HT29细胞的生长和凋亡作用。6、采用western blotting实验检测Cyt-c和caspase-3的蛋白表达,进一步探究NC诱导细胞凋亡的途径。结果:1、NC和SN38对HT29细胞的抑制率增大,并且促进HT29细胞凋亡,与单独SN38给药组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。2、彗星实验结果显示,SN38单独给药时,彗星尾长不明显;而当NC和SN38联合给药时,随着NC浓度的增大,彗星尾长和尾部DNA含量显著增大,与单独SN38给药组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blotting和免疫荧光实验结果表明,NC和SN38联合给药时,p-H2AX蛋白表达水平均显著升高,与单独SN38给药组比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。3、Western blotting实验结果显示,SN38单独给药时,Eme1、p-Src(Tyr419)、Stat3、p-Stat3(Tyr705)、p-Stat3(Ser727)蛋白表达水平均显著升高,与溶剂对照组比较,差异具有统计学意义(P0.05);而NC和SN38联合给药时,上述的五种蛋白水平均明显下降,与单独SN38给药组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。4、荧光显微镜下观察HT29细胞获得较高的转染效率,western blotting实验结果显示Eme1在HT29细胞中稳定表达。彗星实验结果表明,SN38单独给药时,彗星尾长不明显;而当NC给药时,彗星尾长和尾部DNA含量显著增大,与Eme1-OV组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blotting实验结果表明,NC下调了Eme1的蛋白表达水平。5、与溶剂对照组比较,随着NC浓度增加,HT29细胞的抑制率逐渐增大,细胞凋亡率增大,差异具有统计学意义(P0.05)。6、Western blotting实验结果显示,Cyt-c和caspase-3蛋白表达水平均明显升高,与溶剂对照组比较,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:1、NC和SN38对HT29细胞的增殖具有协同抑制作用,NC可以下调Eme1的蛋白表达,阻断DNA损伤修复,从而加重DNA损伤。2、NC阻断DNA损伤修复途径可能与抑制Src-Stat3信号通路有关。3、NC能够抑制HT29细胞的增殖,诱导HT29细胞凋亡,其分子机制可能与Cyt-c/caspase-3介导的线粒体内部凋亡途径有关。
【图文】：

图 1-1 NC 和 SN38 对 HT29 细胞增殖的抑制作用Fig. 1-1 The inhibition effect of NC and SN38 on HT29 cells1 or ***P<0.001, vs 24h SN38 group;＃＃＃P<0.001, vs 48h SN38 group;△△△P<0.001 Svs control group.们进一步应用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡，验证对 HT29 细胞凋亡的协同作用。流式细胞检测仪分析结果表明给药 48h 时细胞凋亡比例是 12.95±7.19%，而 NC (30 和 60μM)药 48h 时，凋亡率分别增加至 22.67±3.82% 和 28.33±6.84%，给药组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，如图 1-2。结果说38 具有协同诱导 HT29 细胞凋亡的作用。

26图 1-2 NC 和 SN38 对 HT29 细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC/PI 流式细胞检测图 B. 细胞凋亡率统计柱形图（ x±s, n=Fig. 1-2 Effect of NC and SN38 on apoptosis in HT29 cellsection of apoptosis using Annexin V-FITC/PI B. Statistical histograms of the apoptosis ( x±s, n=3)*P<0.05 or **P<0.01, vs SN38 group.实验检测 NC 与 SN38 联合用药对 HT29 细胞的 DNA 损 NC 是否阻断了 SN38 引起的 DNA 损伤修复，我们采用NA 损伤的彗星实验技术。在碱性条件下电泳，带负电在凝胶中迁移，经荧光染料染色后，每一个损伤的细胞光头部和尾部，，似彗星形状。彗星的尾长和尾部荧光强
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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本文编号：2679637