α-倒捻子素抗急性肝损伤和抗抑郁作用及机制研究

发布时间：2020-05-25 03:12

【摘要】：山竹果皮在泰国、缅甸、印度等东南亚国家被作为一种传统药物广泛用于治疗疟疾、腹泻、炎症、白血病和败血症。α-倒捻子素(α-mangostin,α-MG)是山竹果皮中的主要活性成分,具有多种药理活性,如抗肿瘤、抗菌、抗癌、抗炎等。结合α-MG已报道的生物活性,急性肝损伤和抑郁的发病机理和病理生理学特征,提出α-MG具有抗急性肝损伤和抗抑郁活性假设。本文以α-MG为研究对象,探索其抗急性肝损伤和抗抑郁药理活性及作用机制。主要研究内容如下:1、α-MG的抗急性肝损伤活性及作用机制通过建立3种不同机理的急性肝损伤模型来探索α-MG的肝保护活性及作用机制。(1)APAP诱导药物性急性肝损伤模型:过量的APAP经细胞色素P450(CYP450)氧化生成有害代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI),NAPQI与GSH结合生成硫醇尿酸或半胱氨酸衍生物而耗竭肝细胞内GSH,从而导致氧化应激、炎症反应和线粒体功能障碍,进而导致急性肝损伤。ICR小鼠连续灌胃给药α-MG(12.5和25 mg/kg)7天,并在最后一天给予α-MG 1h后腹腔注射APAP(300 mg/kg)。在APAP给药24h后,收集肝脏和血清以评估肝毒性。血清用于检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平以及细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平。肝脏组织用于检测肝脏谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)水平。同时通过检测肝组织切片染色、western-blot、RT-PCR等结果来分析α-MG抗药物性肝损伤作用机制。结果表明α-MG能有效降低血清中AST、ALT、TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及提高了肝组织中GSH、SOD和CAT活力,有效降低MDA含量。肝组织病理学观察表明α-MG预处理显著抑制APAP诱导的肝细胞坏死,炎性细胞浸润和充血。Western-blot和RT-PCR检测结果显示,α-MG预处理能有效抑制APAP诱导的ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化,减弱了IκBα的磷酸化和NF-κBp65的转位。同时,α-MG下调了TNF-α和IL-1βmRNA的水平。综上,α-MG对由APAP诱导的急性肝损伤有明显的肝保护作用,通过抑制NF-κB和MAPK信号通路传导来防止APAP诱导的急性肝损伤。其作用机制与其较强的抗氧化和抗炎能力有关。(2)LPS/D-GalN诱导爆发性肝损伤模型:LPS直接激活存在肝星状细胞(HSCs)表面的TLR4,导致炎性细胞因子的释放,引起肝细胞凋亡和坏死;D-GalN消耗尿苷三磷酸酶(UTP),从而抑制肝脏中相关RNA和蛋白质的合成;二者共同作用导致肝脏炎症反应和肝细胞弥漫性坏死,进而导致爆发性肝损伤。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予α-MG(12.5和25 mg/kg)7天,并在最后一天给予α-MG 1h后腹腔内注射LPS(50μg/kg)和D-GalN(800 mg/kg)。在LPS/D-GalN给药8h后获得小鼠血清和肝脏。根据试剂盒说明书测定血清和肝组织中相关指标。同时通过检测肝组织切片染色、western-blot、RT-PCR等结果来分析α-MG抗爆发性肝损伤的机制。结果表明α-MG降低了血清中ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及提高了肝组织中GSH、SOD和CAT的活力,有效降低MDA含量。同时,α-MG能够减轻LPS/D-GalN诱导的肝脏组织病理损伤。Western-blot检测结果显示α-MG抑制LPS/D-GalN诱导的toll样受体4(TLR4)表达和NF-κB活化以及上调了Nrf2和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。综上所述,α-MG对由LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤有明显的肝保护作用。α-MG通过激活Nrf2诱导抗氧化防御和抑制TLR4信号传导途径来防止LPS/D-GalN诱导的肝衰竭。(3)CCl_4诱导化学性急性肝损伤模型:CYP450将CCl_4转化为有毒性的代谢产物,在肝细胞内质网中产生ROS,损伤DNA和生物膜,引发脂质过氧化损伤,诱导肝细胞的基因表达发生改变,肝脏组织细胞还会分泌大量的炎症因子,导致炎症反应,进而导致急性肝损伤。ICR小鼠通过灌胃给药连续给予α-MG(12.5和25 mg/kg)7天,并在最后一天给予α-MG 1h后腹腔内注射0.2%CCl_4。CCl_4造模24h后收集肝脏和血清备用。根据试剂盒说明书测定血清和肝组织中相关指标。同时通过肝组织切片染色、Western-blot、RT-PCR等结果来分析α-MG抗化学性肝损伤的机制。结果表明与模型组相比,α-MG给药组没有降低AST、ALT的水平,表明α-MG不能缓解由CCl_4诱导的肝损伤。2、α-MG抗抑郁活性和作用机理本研究首先采用经典行为学绝望模型悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)来探究α-MG的抗抑郁活性,筛选出有效剂量和亚有效剂量。为了排除行为绝望测试中的假阳性结果,同时测试了α-MG对小鼠自主活动的影响。后续利用联合给药实验测定阻断剂和激动剂对α-MG抗抑郁活性的影响,以及各中枢神经递质在α-MG抗抑郁活性的作用。结果显示α-MG具有较强的抗抑郁活性,α-MG抗抑郁有效剂量为5 mg/kg,亚有效剂量为1mg/kg。对α-MG而言,小鼠在TST中的不动时间变化比在FST中更敏感,表明TST比FST更有利于α-MG的抗抑郁活性的筛选。因此,我们选择TST开展后续实验。联合给药实验结果表明:α-MG(1 mg/kg)与抗抑郁药氟西汀、噻奈普汀和瑞波西汀联合给药后,显著降低了不动时间,表现出协同作用。联合阻断剂和激动剂的结果显示用荷包牡丹碱(一种竞争性GABA拮抗剂),对氯苯丙氨酸(一种5-HT合成抑制剂)和氟哌啶醇(一种非选择性D_2受体拮抗剂)预处理显著逆转了α-MG(5 mg/kg)的抗抑郁作用,并改变脑内相应中枢神经递质水平,这表明α-MG的抗抑郁作用可能由GABA能,5-HT能和多巴胺能系统介导。
【图文】：

结构式,分离方法,提取率

图 1.1 氧杂蒽酮和 α-MG 结构式Fig 1.1 Structure of xanthone and α-MG取分离方法于 α-MG 的提取分离方法很多，最常用的是溶剂提取法，目人[33]以无水乙醇为夹带剂，利用超临界萃取技术和快速制 90%的 α-MG，此方法对于 α-MG 的提取分离和鉴定简单、人[34]以 80%乙醇为溶剂，利用闪式提取法提取出粗提物。然后。结果发现 α-MG 质量分数为 6.72%，，此方法提取率比较高山竹果皮粉末按一定料液比加入乙醇溶解，利用超声法进行最佳试验方案。超声提取是一种纯物理方法，提取效果明显，此方法提取率高、耗能少、操作简便。理活性研究广泛的药理活性，如用作乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤癌具有抗炎、抗菌、抗疟、抗肥胖等作用。此外，α-MG 具有维

峰面积,杂质峰,对照品,纯度

1.1.3 实验结果1.1.3.1 α-MG 纯度检测结果α-MG 纯度检测结果如表 1-2 和图 1.1 所示，杂质峰峰面积与对照品峰面积相比，经过计算，杂质峰所占峰面积为 1.32 %，即 α-MG 的纯度为 98.68%。表 1-2 α-MG 及其杂质的峰面积Table 1-2 Peak area of α-MG and its impurities组别时间峰面积A-对照品 11.129 2837634B-供试品 5.267 3432876.842 15420488.697 8264879.19611.073423377985743116.247 627351
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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