【摘要】：目的:研究补肾活血汤对兔软骨细胞的增殖作用及对细胞因子IL-1、IL-6、IGF-1、TGF-βmRNA和NF-kbp65蛋白表达水平的影响,并初步探讨其对骨质疏松症并骨性关节炎两者共病的作用,为补肾活血法治疗两者共病提供理论依据。方法:30只新西兰雌性大白兔,被随机分为A(OP模型组,n=10)、B(OA模型组,n=10)、C组(OP并OA模型组,n=10)三组。A组按Calvo的造模方法进行OP造模,B组按Hulth的造模方法进行OA造模,C组综合上述两组造模方式进行OP并OA造模,各组均提取右膝关节软骨组织分离培养软骨细胞。MTT法观察7组含药血清(正常血清组、低剂量补肾活血汤组、中剂量补肾活血汤组、高剂量补肾活血汤组、盐酸氨基葡萄糖组、阿仑膦酸钠组、盐酸氨基葡萄糖+阿仑磷酸钠组)对兔软骨细胞增殖的影响;PCR法检测7组药物对兔软骨细胞中细胞因子IL-1、IL-6、IGF-1、TGF-βmRNA表达的影响;蛋白印迹法(Western blot)检测7组药物对兔软骨细胞NF-kbp65蛋白相对表达量的影响。结果:1.A、B、C三组细胞随着传代数的增加,Ⅱ型胶原免疫组化的MOD呈现一个递减趋势,即P1P3P5,且Pi、P3、P5之间差异具有显著性(P0.05)。在固定细胞代数的情况下,三组细胞在P1及P3对比差异有显著性(P0.05),但在P5期,三组软骨细胞对比差异无显著性(F=2.180,P=0.1480.05),进一步两两比较发现A组与C组在P1及P3期比较,差异有显著性(P0.05)。2.MTT检测法显示:随着药物作用时间的延长至第7天。(1)除B组细胞中低剂量组与正常组对比,差异无显著性(t=-2.152,p=0.0980.05)外,其他各剂量补肾活血汤组与正常组对比OD值均增高,差异均有显著性(P0.05)。由此可知补肾活血汤有促软骨细胞增殖的作用。(2)高剂量组与低剂量组对比OD值增高,差异有显著性(P0.05),低剂量组与中剂量组及中剂量组与高剂量组在B、C组中对比,差异有显著性(P0.05)。且在A、B、C三组中OD值高剂量组中剂量组低剂量组。由此可知三种剂量的补肾活血汤中,高剂量组促软骨细胞增殖作用最明显,补肾活血汤促软骨细胞增殖作用呈现剂量-时间-效益关系。(3)高剂量组与阿仑组及盐酸组对比,除高剂量组与盐酸组在A组细胞中差异无显著性(t=1.566,p=0.1920.05)外,高剂量组在其他组中的作用均优于阿仑组及盐酸组,差异有显著性(P0.05);高剂量组与盐+阿组对比,在三组细胞中差异均无显著性(P0.05)。由此可知高剂量组促软骨细胞增殖作用与盐+阿组相当,优于阿仑组及盐酸组。3.PCR结果显示:(1)各剂量补肾活血汤组与正常组比较,除低剂量补肾活血汤组在OA组中与正常组对比差异无统计学意义外(t=2.866,P=0.0580.05),其它剂量补肾活血汤与正常组对比均有降低软骨细胞内IL-1mRNA表达的作用,差异有显著性(P0.05),其中以高剂量组的下调幅度最为明显,与低、中剂量组比较差异有显著性(P0.05);高剂量组与盐酸组对比IL-mRNA表达更低,差异有显著性(P0.05),高剂量组与阿仑组及盐+阿组对比在OP组及OA+OP组中差异不显著(P0.05),但在OA组中差异有显著性(P0.05)。由此可知高剂量组降低IL-1mRNA的表达作用优于盐酸组与阿仑组及盐+阿组大体相当。(2)各剂量补肾活血汤组与正常组对比均有降低细胞内IL-6mRNA表达的作用,其中以高剂量组降低IL-6mRNA表达作用最明显,与低、中剂量组对比,差异有显著性(P0.05);高剂量组与阿仑组对比降低IL-6mRNA作用更明显,差异有显著性(P0.05),高剂量组与盐+阿组对比差异无显著性(P0.05),高剂量组与盐酸组在OA组中对比,差异无显著性(t=-1.399,p=0.2110.05),在OP组及OA+OP组中降低IL-6mRNA作用更明显,差异均有显著性(P0.05)。由此可知高剂量组降低细胞内IL-6mRNA的表达作用与盐+阿组相当,优于阿仑组及盐酸组。(3)中、高剂量组与正常组对比均有增高细胞内IGF-1mRNA表达的作用,差异有显著性(P0.05),且中剂量组与高剂量组对比,差异有显著性(P0.05);高剂量组与阿仑组对比升高IGF-1mRNA表达的作用更明显,差异有显著性(P0.05),高剂量组与盐酸组及盐+阿组对比在三组细胞中差异无显著性(P0.05)。(4)各剂量补肾活血汤组与正常组对比,均有升高细胞内TGF-βmRNA表达的作用明显,差异有显著性(P0.05),上调TGF-βmRNA表达的作用高剂量中剂量低剂量,且各剂量组之间比较,差异有显著性(P0.05);高剂量组与阿仑组对比,差异无显著性(P0.05),高剂量组与盐酸组对比在OA组及OA+OP组中差异无显著性(P0.05),但在OP组中差异有显著性(t=2.455,p=0.0490.05),高剂量组与盐+阿组对比,在OA组及OP组中差异无显著性(P0.05),但在OA+OP组中差异有显著性(t=-5.526,p=0.0010.05)。由此可知高剂量组上调软骨细胞中TGF-βmRNA的作用与盐酸组、阿仑组、盐+阿组大体相当。4.Western-blot结果显示:中、高剂量组有下调细胞中NF-kbp65蛋白的作用,与正常组对比差异有显著性(PO.05),其中以高剂量组作用最为明显,与低、中剂量组对比差异有显著性(P0.05);高剂量组下调NF-kbp65蛋白表达的作用较阿仑组及盐酸组明显,差异有显著性(P0.05);高剂量组与盐+阿组在OP组对比差异有显著性(t=7.597,p=0.0020.05),但在OA组及OA+OP组中则差异无显著性(P0.05),由此可知高剂量组下调NF-kb p65蛋白表达的作用优于阿仑组及盐酸组,与盐+阿组大体相当。结论:1、A、B、C三组动物模型中均能成功提取出软骨细胞,C组与A组比较软骨细胞分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原酶的能力下降。2、补肾活血汤有促软骨细胞增殖的作用,且呈现剂量-时间-效益关系,以高剂量补肾活血汤组作用最明显。3、补肾活血汤、阿仑磷酸钠、盐酸氨基葡萄糖、盐酸+阿仑均有促进软骨细胞增殖的作用,其机制可能与其提高软骨细胞内IGF-1、TGF-βmRNA表达,下调IL-1、IL-6mRNA表达及NF-kbp65蛋白表达有关,从而间接或直接起到保护或修复软骨细胞的作用。
【图文】：
图３培养５天的原代软骨细胞，镜下见细胞呈多角形或梭形（２０００逡逑２．２软骨细胞鉴定逡逑２．２．１甲苯胺蓝染色逡逑由图４－图１２可知软骨细胞甲苯胺蓝染色，细胞质呈淡蓝色，细胞
图３培养５天的原代软骨细胞，镜下见细胞呈多角形或梭形（２０００逡逑２．２软骨细胞鉴定逡逑２．２．１甲苯胺蓝染色逡逑由图４－图１２可知软骨细胞甲苯胺蓝染色，细胞质呈淡蓝色，，细胞
【学位授予单位】：贵阳中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332
【参考文献】
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本文编号：
2680531
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