外敷消瘀接骨散对KOA模型大鼠膝关节滑膜组织中MMP-1,MMP-3表达影响的实验研究

发布时间：2020-05-25 19:38

【摘要】：背景:膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是以软骨分解、破坏,骨组织重建、增生为病理改变,以疼痛、关节活动受限为主要临床表现的多发骨科疾病。该病在中老年人群中普遍存在,使患者饱受因反复疼痛及对致残的恐慌而带来的巨大精神压力。有研究证实膝关节滑膜炎是膝骨关节炎发病及发展的关键推动因素。软骨降解的碎片引起滑膜的炎症反应,炎症滑膜又进一步释放炎性递质、细胞因子及蛋白酶等,反作用于软骨,加剧软骨破坏。若能早期、有效的减轻滑膜的炎性反应,减少对软骨的破坏,则可以显著减缓膝骨关节炎的发展。中药外治法可以将中草药中的有效成分通过透皮吸收而作用于患处,具有方便、安全、经济适用等优点。消瘀接骨散是国家级名老中医丁锷教授创立的外用方药,在安徽中医药大学第一附属医院骨伤科中广泛应用于膝骨关节炎的治疗,可以有效缓解膝骨关节炎早期出现的关节疼痛、肿胀,临床疗效显著,但目前尚不清楚其作用机制。目的:通过建立大鼠早期膝骨关节炎模型,观察外敷消瘀接骨散对膝骨关节炎滑膜组织中基质金属蛋白酶1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP-1)、基质金属蛋白酶3(Matrix Metalloproteinase-3,MMP-3)的表达影响,以及观察膝关节滑膜组织在治疗前后的病理改变,探究消瘀接骨散治疗膝骨关节炎的具体作用途径和方式。方法:选取3月龄健康雄性SD大鼠75只,体重250~300g,依照随机数字表法各随机抽取14只,分为正常组和假手术组,分笼饲养;其余47只进行手术造模,建立膝骨关节炎模型。假手术组仅为验证手术创伤因素是否影响实验结果,术后一周开始,每日定时驱赶所有组大鼠奔跑,强迫活动右下肢,每次30min,持续4周。4周后,在手术造模大鼠中随机抽取5只处死,检验造模是否成功。造模成功后,将手术造模组42只大鼠随机分为3组,即模型组、消瘀接骨散组(中药组)、扶他林组(西药组),每组14只,每组实验动物按照实验设计药物剂量给药。给药4周后,处死所有动物,提取标本制作苏木精-伊红染色病理切片,进行光镜下观察。同时分别采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,RTFQ PCR),蛋白质印记法(Western Blotting,WB)和酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测滑膜组织中MMP-1和MMP-3的相对表达量,并进行统计学分析。结果:在一个疗程治疗结束后,模型组大鼠滑膜组织中MMP-1和MMP-3的m RNA含量高于其余各组(P0.05),MMP-1消瘀散组和扶他林组之间比较均无明显差异(P0.05),MMP-3消瘀散组表达量略低于扶他林组,差异有统计学意义(P0.05);蛋白质印迹法分析则表明MMP-1和MMP-3在模型组大鼠滑膜组织中大量表达,与消瘀散组和扶他林组分别比较,差异都存在统计学意义(P0.05),消瘀散与扶他林组之间比较,无显著差别(P0.05);酶联免疫吸附法分析指出MMP-1和MMP-3两种蛋白在模型组中被大量分泌至大鼠滑膜组织中,与消瘀散组和扶他林组分别比较,差异存在统计学意义(P0.05),MMP-1消瘀散组和扶他林组比较,无显著性差异(P0.05),MMP-3消瘀散组表达量略低于扶他林组,差异存在统计学意义(P0.05);滑膜组织病理切片观察发现,模型组滑膜有明显增生并伴随炎性细胞大量浸润,周围血管显著增生,与模型组比较消瘀散组滑膜增生相对较少,少量炎性细胞浸润并伴有少量血管增生,扶他林组相比模型组滑膜增生较少,血管增生和炎性细胞浸润均与消瘀散组大致相当。结论:此次实验研究发现消瘀接骨散可以有效减轻大鼠早期膝骨关节炎模型滑膜炎症的病理改变,并能显著减少滑膜组织中参与软骨基质破坏与降解的两种关键蛋白酶MMP-1和MMP-3的m RNA表达量,蛋白合成及分泌量。中药与西药抑制MMP-1在KOA滑膜组织表达的作用相同,在抑制MMP-3在KOA滑膜组织表达的作用方面中药组优于西药组。其作用机制可能是消瘀接骨散能有效缓解滑膜炎症,抑制MMP-1和MMP-3的表达,减少关节软骨的降解与破坏,从而减轻膝骨关节炎的症状及疾病进展。
【图文】：

3 结果.1 造模结果及过程中大鼠行为表现造模前观察所有大鼠，均无后膝关节的异常表现，饮食及活动状态良好。按照实验设行造模，在手术方式造模的 47 只大鼠中，有 2 只因麻药过量而死亡，剩余 45 只均在成功后 1 小时左右苏醒，造模后 2~3 天逐渐恢复正常活动，术后 7 天切口愈合良好，遂予以缝线；术后 1 周开始每日驱赶所有组动物奔跑 30min，持续 4 周，4 周后所有大鼠精神状良好，，造模后的大鼠出现右后膝关节活动度差，大鼠跛行等，在行手术的大鼠中随机抽取，处死后切开关节囊发现关节囊略有增生，关节滑液变多且呈淡黄色，软骨表面略显粗部分溃疡和缺损，软骨边缘骨赘形成不明显，取患侧关节滑膜制作 HE 病理切片观察见滑织增生明显，细胞间隙及滑膜外层出现中量炎细胞浸润并见大量血管增生（图 1-4），符起 KOA 样改变，证实造模成功。

3 结果.1 造模结果及过程中大鼠行为表现造模前观察所有大鼠，均无后膝关节的异常表现，饮食及活动状态良好。按照实验设行造模，在手术方式造模的 47 只大鼠中，有 2 只因麻药过量而死亡，剩余 45 只均在成功后 1 小时左右苏醒，造模后 2~3 天逐渐恢复正常活动，术后 7 天切口愈合良好，遂予以缝线；术后 1 周开始每日驱赶所有组动物奔跑 30min，持续 4 周，4 周后所有大鼠精神状良好，造模后的大鼠出现右后膝关节活动度差，大鼠跛行等，在行手术的大鼠中随机抽取，处死后切开关节囊发现关节囊略有增生，关节滑液变多且呈淡黄色，软骨表面略显粗部分溃疡和缺损，软骨边缘骨赘形成不明显，取患侧关节滑膜制作 HE 病理切片观察见滑织增生明显，细胞间隙及滑膜外层出现中量炎细胞浸润并见大量血管增生（图 1-4），符起 KOA 样改变，证实造模成功。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332

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本文编号：2680641