液相色谱—串联质谱法同时测定大鼠血浆中黄酮醇糖苷及其主要代谢物

发布时间：2020-05-26 23:06

【摘要】：背景黄酮醇糖苷(代号GDH),是在中药提取物3,3',4'-三羟基黄酮的基础上进行结构修饰得到的人工合成的候选新药,具有改善血液循环,降低胆固醇的作用,有很好的降血脂活性,目前处于临床研发阶段。目的建立快速、灵敏的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中的黄酮醇糖苷(M0)、苷元(M1)和葡萄糖醛酸结合物(M2),并将验证后的方法应用于黄酮醇糖苷的大鼠药代动力学研究,为黄酮醇糖苷的临床试验设计提供依据。方法大鼠血浆样品经甲醇(含0.2%甲酸)沉淀蛋白后,以去离子水(含0.2%甲酸)-甲醇为流动相进行梯度洗脱,色谱柱为XDB C_(18)(50×4.6 mm,1.8μm),色谱运行时间为4.5min。质谱检测采用电喷雾电离源(ESI),正离子模式进行多重反应监测(MRM)。用于定量分析的离子对分别为m/z 461.3→m/z 299.1(黄酮醇糖苷,M0),m/z 299.1→m/z 283.1(苷元,M1),m/z 475.0→m/z 299.1(葡萄糖醛酸结合物,M2)和m/z 467.3→m/z 305.1(d_6-黄酮醇糖苷,IS)。结果测定大鼠血浆中黄酮醇糖苷标准曲线的线性范围为2.00ng·mL~(-1)~400 ng·mL~(-1),苷元的线性范围为2.00 ng·mL~(-1)~400 ng·mL~(-1),葡萄糖醛酸结合物的线性范围为5.00 ng·mL~(-1)~1000 ng·mL~(-1)。待测物低、中、高质控样品的日内和日间的精密度和准确度均符合生物样品测定相关要求。考察大鼠全血样品室温放置2 h,血浆样品室温放置6 h,血浆样品经沉淀蛋白处理后室温放置6 h,自动进样器放置24 h,血浆样品-20°C放置50天,血浆样品-70°C放置50天,-20°C经历3次冷冻-解冻循环,-70°C经历3次冷冻-解冻循环等条件下的稳定性,结果表明:黄酮醇糖苷、苷元和葡萄糖醛酸结合物的大鼠血浆及全血样品在上述储存条件下均稳定。SD大鼠经灌胃给予黄酮醇糖苷30 mg·kg~(-1)后,M0的C_(max)为(341±106)ng·mL~(-1),AUC_(0-t)为(1960±725)h·ng·mL~(-1);M1在血浆中的含量低于分析方法的定量下限2 ng·mL~(-1),无法测定相应浓度计算C_(max)和AUC_(0-t);M2的C_(max)为(1720±843)ng·mL~(-1),AUC_(0-t)为(8510±2920)h·ng·mL~(-1)。其中M2的C_(max)为M0的5.0倍,AUC_(0-t)为M0的4.3倍。结论本实验建立了准确、灵敏的LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中的黄酮醇糖苷、苷元和葡萄糖醛酸结合物,并进行了完整的方法验证,最后将验证后的方法成功应用于黄酮醇糖苷的大鼠药代动力学研究。实验结果表明,在SD大鼠血浆中,黄酮醇糖苷主要以原形和葡萄糖醛酸结合物这两种形式存在,且M2的暴露量显著高于M0,推测黄酮醇糖苷经口服给药后在体内经肠菌群水解成苷元形式被吸收,经历较强的首过代谢后,苷元进一步生成葡萄糖醛酸结合物。本文首次测定了黄酮醇糖苷在大鼠血浆中的主要代谢物,为临床药动学试验设计提供了依据。对于黄酮类化合物的药动学研究,不仅要关注原形药物,而且更要关注其代谢物,后者在血浆中的暴露量通常远高于前者。
【图文】：

化学结构,储备液,配制标准系列,葡萄糖醛酸结合物

I II图 2-3 d3-黄酮醇糖苷、d6-黄酮醇糖苷的化学结构Figure 2-3 Structures of d3-flavonol glycoside and d6-flavonol glycoside液的配制精密称取黄酮醇糖苷、苷元和葡萄糖醛酸结合物对照品各两份，用并用甲醇定容，，获得质量浓度均为 1.00 mg·mL-1的 M0、M1、M2，分别用于配制标准系列样品和质控样品。醇-水（50:50，v/v）稀释 M0、M1、M2 储备液及质控储备液，M2 质量浓度为 40.0/40.0/100、80.0/80.0/200、200/200/500、400/400/100/2500、2000/2000/5000、4000/4000/10000、8000/8000/20000 ng准系列溶液，分别取上述混合标准系列溶液 10 μL，加入大鼠空白获得 M0/M1/M2 浓度为 2.00/2.00/5.00、4.00/4.00/10.0、10.0/10.0/2
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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