丹皮酚对人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡诱导作用的实验研究

发布时间：2020-05-26 23:56

【摘要】：目的通过体外实验研究丹皮酚对人鼻咽癌细胞株CNE-1的增殖抑制作用,并运用现代生物分子学实验方法初步探讨丹皮酚诱导CNE-1凋亡的内在机制(Bax和Bcl-2蛋白),为临床治疗鼻咽癌能够增加一种新的低毒、高效的中药治疗药物提供初步的实验基础。方法1四甲基偶氮唑盐(MTT)法:检测丹皮酚对人鼻咽癌CNE-1细胞增殖活性的影响。将丹皮酚用完全培养基稀释为不同的剂量(0.006mol/L、0.012 mol/L、0.024mol/L),按照选取的不同时间长度24h、48h和72h分别用药于CNE-1细胞,并以阴性对照组和阳性对照组作对比,观察显微镜下各组细胞的形态变化,通过测量的吸光度值计算丹皮酚对CNE-1的增殖抑制率,并通过统计分析方法分析其结果。2免疫荧光染色法(AO/EB):观察丹皮酚诱导CNE-1凋亡后的细胞形态变化。将丹皮酚低、中剂量组和CNE-1阴性组分别培养24h和48h后,收集并洗涤细胞,用AO/EB荧光染色,在荧光倒置显微镜下观察细胞是否有凋亡的形态变化。3流式细胞检测术:检测丹皮酚诱导CNE-1凋亡后细胞凋亡率和细胞生长周期的变化。将丹皮酚低、中剂量组和CNE-1阴性组分别培养48h后,收集并洗涤细胞,分别采用Annexin V-FITC、PI双染法和PI单染法检测细胞凋亡率和细胞生长周期的变化,并用统计软件分析其结果。4免疫印迹法(Western Blot):检测细胞内凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达情况。将丹皮酚低、中剂量组和CNE-1阴性组分别培养48h后分别收集细胞并提取蛋白,采用免疫印迹技术检测Bax和Bcl-2的相对表达量,并用统计软件分析其结果。结果1 MTT检测结果:通过和阴性组作比较,丹皮酚能够抑制人鼻咽癌CNE-1细胞的增殖活性,差异显著有统计学意义(P㩳0.001),并随着用药剂量的增加和用药时间的延长,抑制率升高,线性回归分析有统计学意义(P㩳0.001)。2 AO/EB荧光染色结果:倒置显微镜下观察,与阴性组呈现全视野绿色圆匀的正常CNE-1细胞形态对比,丹皮酚低中剂量用药组均呈现出一定比例的橘黄色凋亡形态细胞,甚至可见呈橘红色的固缩和新月形细胞,并且中剂量用药组橘黄色细胞的比例高于低剂量用药组,诱导CNE-1 48h后的橘黄色细胞比例高于诱导CNE-124h后。3流式细胞仪结果:(1)丹皮酚低、中剂量用药组CNE-1细胞总凋亡率均高于阴性组,并且中剂量组高于低剂量组,差异显著有统计学意义(P值均小于0.001);(2)丹皮酚低、中剂量用药组S期细胞数目比值均高于CNE-1阴性组,并且中剂量用药组S期细胞数目的比值高于低剂量用药组,差异显著,有统计学意义(P值均小于0.01)。4免疫印迹结果:CNE-1细胞内Bax蛋白的表达量随着丹皮酚用药剂量的增加其相对表达量增加,Bcl-2正好相反,随着丹皮酚用药剂量的增加Bcl-2的相对表达量减少,通过统计分析,其结果差异显著具有统计学意义(P㩳0.01)。结论1丹皮酚具有抑制人鼻咽癌细胞CNE-1增殖活性的作用,并具有用药时间相关性和用药剂量依赖性。2丹皮酚抑制人鼻咽癌CNE-1细胞增殖的机制可能与生长周期阻滞于S期和细胞凋亡有关,并且生长周期阻滞于S期也可能会引发细胞凋亡。3丹皮酚诱导CNE-1细胞凋亡的作用,可能与Bax相对表达量上调和Bcl-2相对表达量降低有关,这可能与线粒体凋亡通路有关,有待进一步研究探讨。
【图文】：

曲线,曲线,橘黄色,丹皮酚

2 荧光染色显微镜下观察细胞形态（AO/EB）正常的 CNE-1 阴性对照组细胞荧光下见其细胞核染色质被着染成绿色，形圆质匀结构正常；而丹皮酚用药组镜下可见三种颜色，绿色、橘黄色和红色，并且部分形态结构异常。其中丹皮酚中剂量组着橘黄色和红色的细胞数量多于低剂量组，呈碎块状，并且随着时间延长见各用药组被着染为橘黄色的细胞数量增多（附图 1）。3 FCM 测定细胞凋亡率和周期变化3.1 FCM 检测细胞凋亡率只被 AnnexinV-FITC 染色的为早期凋亡细胞（附图 2，见 Q3 象限），能同时被 AnnexinV-FITC 和 PI 染色的为晚期凋亡细胞（见 Q2 象限），只能被 PI 染色的

丹皮酚,早期凋亡,剂量效应关系,低剂量

异具有统计学意义(P < 0.05)。说明丹皮酚能够诱导 CNE-1 细胞凋亡。线性析剂量效应关系显著(P < 0.05)，具有剂量依赖性（表 2、图 2）。表 2 Pae 作用于 CNE-1 细胞凋亡率的变化（处理 48h,%）（x—±s,n=3）组别早期凋亡率晚期凋亡率总凋亡阴性对照 2.636±0.325 3.483±0.185 6.120±0.Pae 低剂量 16.133±0.569* 5.337±0.360* 21.470±0Pae 中剂量 14.533±2.554* 16.967±1.290* 31.400±2注：与阴性组凋亡率相比，* P㩳0.05，△P㩳0.001。
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】