CXCL12及其受体CXCR4信号对佐剂性关节炎大鼠滑膜血管增生和内皮细胞功能的影响及CP-25作用

发布时间：2020-05-27 06:49

【摘要】：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎、骨与软骨破坏为特点的自身免疫性疾病。病理过程主要是炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成。在RA中,滑膜组织新生血管及血管翳的形成是其重要表现,关节内巨噬细胞、滑膜成纤维细胞及内皮细胞分泌多种促血管生成因子,如血管内皮生长因子、缺氧诱导因子、各种趋化因子及促炎性细胞因子等,这些促血管生成因子主要通过新生血管维持滑膜及关节内的炎症。CXCL12属于趋化因子家族CXC类,具有多种生物学功能,对淋巴细胞具有强烈的趋化作用,参与多种疾病的发生发展,如艾滋病、癌症、自身免疫性疾病等。在RA中,CXCL12及其受体CXCR4在关节滑膜细胞、内皮细胞均高表达,参与RA的病理过程,如炎性细胞浸润在关节组织、滑膜细胞异常增生以及血管翳形成等。而血管翳形成是RA患者关节滑膜增生及炎症形成的重要原因之一,CXCL12/CXCR4轴在RA患者关节中参与血管重塑和生成,研究发现,在大鼠关节炎模型中使用CXCL12阻滞剂AMD3100阻断CXCL12/CXCR4轴后发现,血管重塑障碍,新生的内皮细胞形态异常,毛细血管的生长亦受到抑制等。CXCL12通过G蛋白偶联受体的信号通路调节ERK1/2的活化是血管内皮、细胞增生的重要机制,在内皮细胞中,G蛋白偶联受体激酶2(G protein coup、led receptor kinase 2,GRK2)负性调节CXCR4受体,可以介导其内吞与脱敏。芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)是本课题组对芍药苷(paeoniflorin,Pae)结构进行酯化修饰得到的新型活性单体。前期本课题组已研究CP-25较Pae生物利用度高、半衰期长、起效快等优点,同时前期研究表明CP-25(25、50、100 mg·kg~(-1))对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)大鼠有确切的治疗作用,可以显著降低AA大鼠关节炎症,改善滑膜细胞异常增殖等,但其对AA关节的血管增生及血管翳影响机制尚不清楚。本课题在课题组既往的研究基础上,通过建立大鼠AA模型,在体内观察AA模型中关节组织血管增生以及CXCL12/CXCR4表达情况,明确CXCL12/CXCR4与AA大鼠血管增生的关系以及CP-25的作用;体外以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)作为研究对象,观察CXCL12/CXCR4对内皮细胞功能的影响及CP-25的作用,为进一步揭示CXCL12/CXCR4信号转导参与RA异常的病理过程的机制,以及CP-25的抗炎免疫调节作用的机制提供依据。目的:1.建立AA大鼠模型,观察CP-25的治疗作用及CXCL12/CXCR4轴在AA大鼠滑膜组织、血清及脾脏组织中的变化,明确CXCL12/CXCR4轴在AA大鼠中的作用;2.观察CXCL12/CXCR4轴在AA大鼠滑膜血管壁的变化,明确CXCL12/CXCR4与AA大鼠血管增生的关系;3.观察CXCL12对HUVECs功能的影响以及CP-25的作用,研究GRK2、CXCR4以及ERK1/2表达情况,揭示GRK2通过调节CXCR4-ERK信号通路改善内皮细胞功能以及CP-25的作用。方法:1.应用完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)建立大鼠AA模型。造模成功后分为正常组、模型组、CP-25(50mg·kg~(-1))组及MTX(0.5 mg·kg~(-1))组,第17天采用灌胃方式给药14次,第30天处死大鼠。记录大鼠多发性关节炎指数、关节肿胀指数、体重、病理组织学、滑膜炎症评分及血管翳评分;2.AA大鼠关节滑膜及、脾脏的病理情况,用HE染色评价滑膜及脾脏的病理情况;免疫荧光评价滑膜血管增生;免疫组化法和ELISA法检测关节滑膜、脾脏及血清的CXCL12的表达水平;Western blot法检测关节滑膜及脾脏的CXCR4的表达水平;3.CCK-8法检测CXCL12及CP-25对HUVEC增殖能力的影响;Transwell法、检测CXCL12及CP-25对HUVEC迁移能力的影响;成管实验检测CXCL12及CP-25对HUVEC形成血管能力的影响;4.Western blot方法检测CXCL12及CP-25对HUVECs CXCR4、GRK2总蛋白、胞膜及胞质以及ERK、p-ERK的表达;免疫共沉淀法测GRK2与CXCR4、GRK2与p-ERK之间的共表达。结果:1.CP-25可改善AA大鼠的关节炎表现、脾脏和关节病理,抑制滑膜细胞异常增殖,抑制关节滑膜血管增生:CP-25(50 mg/kg)能明显缓解AA大鼠关节炎表现,包括多发性关节炎指数、关节肿胀指数;CP-25(50 mg·kg~(-1))可改善AA大鼠的脾脏病理改变,包括降低动脉周围淋巴细胞的数量,同时关节的病理学检测提示CP-25(50 mg·kg~(-1))能明显减少滑膜组织增生及炎性细胞浸润,降低滑膜组织炎性浸润评分和血管翳评分。2.AA大鼠滑膜、脾脏中CXCL12/CXCR4的表达及血清中CXCL12表达的变化及CP-25的作用:AA大鼠滑膜、脾脏中CXCL12/CXCR4的表达较正常组均明显升高,CP-25对其具有下调作用,且滑膜组织中CXCL12/CXCR4的表达与滑膜组织血管翳评分成正相关关系。3.CXCL12对HUVEC增殖、迁移、成管能力的影响及CP-25的作用:CXCL12(50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明显增加HUVEC增殖,CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))能明显降低CXCL12(50 ng·m L~(-1))刺激HUVEC的异常增殖;CXCL12(12.5,25,50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明显增加HUVEC的迁移能力,且在24 h达到峰值,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol·L~(-1))均能明显下调CXCL12(50 ng·m L~(-1))所引起HUVEC的迁移增加;CXCL12(12.5,25,50,100,200 ng·m L~(-1))刺激能明显增加HUVEC的成管能力,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)、10~(-9)mol·L~(-1))均能明显抑制调CXCL12(50 ng·m L~(-1))所引起HUVEC的成管能力增加。4.CXCL12对HUVEC的CXCR4、GRK2、ERK和p-ERK表达的影响及CP-25的作用:CXCL12(100 ng·m L~(-1))刺激HUVEC后其GRK2总表达升高、胞质表达减少而胞膜表达升高,CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))可调节其异常表达;刺激后CXCR4总表达不变,但胞质表达升高而胞膜表达减少,而CP-25(10~(-5)、10~(-6) mol·L~(-1))可调节其回归正常;CXCL12(100 ng·m L~(-1))及CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)mol·L~(-1))对HUVEC的ERK表达均无明显影响,但CXCL(100 ng·m L~(-1))刺激后p-ERK表达增加,CP-25(10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)mol·L~(-1))则可下调其异常升高;CXCL12(100 ng·m L~(-1))刺激HUVEC后,上调GRK2与CXCR4的共表达,下调GRK2与p-ERK的共表达,CP-25(10~(-6) mol·L~(-1))则可对抗CXCL12的作用。结论:1.CP-25对大鼠AA具有治疗作用,可以降低AA大鼠全身表现评分、降低AA大鼠的足爪肿胀度;2.CXCL12及其受体CXCR4的高表达与AA大鼠关节滑膜炎性病变及血管增生有关;3.CP-25可抑制CXCL12诱导的HUVECs增殖、迁移、成管能力;4.CP-25对大鼠AA的治疗作用与抑制其关节滑膜血管增生相关,其作用机制可能与抑制血管内皮细胞GRK2的膜表达,增加其胞质表达,恢复胞质GRK2对ERK活化的抑制有关。
【图文】：

分子式

转运蛋白 4（glucose transporter 4，GLUT4），，增加核转录actor-κB，NF-κB）的转录活性，在糖尿病患者中产生胰岛素抵RK2 表达异常以及功能的紊乱，在 RA 中主要表现为炎性因子软骨及骨破坏等[29]。在既往的研究基础上，通过建立大鼠 AA 模型，观察 CXCL12的滑膜、脾脏中的变化以及 CP-25 对其影响，重点以关节滑膜皮细胞为研究对象，观察AA模型血管增生情况、关节滑膜中的表达情况及其与血管增生相关性，同时在体外实验中观察生物学功能影响及 CP-25 的作用，通过检测 CXCL12/CXCR4况、GRK2 和 CXCR4 表达情况及变化趋势以及 GRK2 与 C情况，进一步揭示 CXCL12/CXCR4 信号在 AA 大鼠滑膜血管能机制，以及 CXCL12/CXCR4 信号在内皮细胞生物学功能中，为揭示 CP-25 的抗炎和免疫调节作用的新机制提供理论依

CXCL12及其受体CXCR4信号对佐剂性关节炎大鼠滑膜血管增生和内皮细胞功能的影响及CP-25作用

CP-25对AA大鼠体重的影响（x±s，n=10）
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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