基于蛋白质组学的柴胡皂苷A抗抑郁靶标蛋白的筛选及作用机制研究

发布时间：2020-05-27 04:17

【摘要】：背景抑郁症是一类常见的精神神经系统疾病,具有长时间情绪低落、思维滞缓、运动抑制的“三大特征”以及高发病率、高复发率、高自杀率的“三高特点”。近年来,伴随经济的迅猛发展和各种压力源的增加,抑郁症的发病率急剧攀升。大量的抗抑郁药物相继涌现并应用于临床,这些药物能够在一定程度上缓解病人的抑郁样症状,但是并不能彻底治愈抑郁症,并且这些药物价格昂贵、起效缓慢、复发率高、还会引起一系列严重的并发症。这些因素严重限制了抗抑郁药物的治疗效果,因此开发更为安全有效的抗抑郁药物已成为当今亟待解决的问题。柴胡皂苷A(Saikosaponin A,SA)是从中药柴胡的干燥根中提取的一种五环三萜类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抑制肿瘤细胞增殖及保护肝脏的功效。目前研究初步证实SA具有一定的抗抑郁作用,但是其具体作用机理仍不明确。所以,深入探究SA的抗抑郁作用机理,可为开发新的安全有效的抗抑郁药物提供必要的理论和实验依据。目的寻求SA发挥抗抑郁作用的靶标蛋白,阐明其抗抑郁作用机制,为开发新型抗抑郁药物提供理论和实验依据。方法1.采用慢性轻度不可预知性应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)结合孤养的方法制备抑郁大鼠模型,并以灌胃方式进行给药。将45只大鼠随机分为 Control 组(C 组,15)、CUMS 组(M 组,15)、CUMS+SA 组(SA 组,15)。整个模型制备过程持续10周,第1周进行适应性饲养,第2-9周进行应激刺激(刺激4周后开始给药,持续给药4周,给药的同时刺激不停止),第10周依据敞箱实验、糖水偏嗜实验等行为学实验评估模型的制备情况。2.行为学实验完成后处死所有实验大鼠,分离海马组织。3.采用高效液相色谱-质谱联用(High performance liguid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)技术测定海马组织中的单胺类神经递质:多巴胺(Dopamine,DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)的含量。4.利用同位素标记的相对和绝对定量(isobaric lags for relative and absolute quantification,iTRAQ)蛋白质组学技术,筛选应激前后及服用SA前后的大鼠海马组织内的差异表达蛋白。5.选取与抑郁症发病密切相关的靶标蛋白-富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2,PRRT2)作为进一步的研究对象,利用Western Blotting技术在组织水平上对PRRT2的表达量进行初步验证。6.在细胞水平,进一步探究SA对接受应激刺激的神经细胞是否具有一定程度的保护作用。采用皮质酮刺激PC12细胞的方法制备抑郁症细胞模型,然后利用CCK8法检测SA对应激损伤的PC12细胞成活率的影响,并采用Western Blotting技术检测SA对应激损伤的PC 12细胞内蛋白PRRT2表达量的影响。结果1.长达8周的CUMS结合孤养的方法可以成功建造大鼠抑郁模型。受刺激的大鼠会产生一系列的抑郁样症状.:食欲下降,体重增长减慢,活动量下降,对糖水的偏嗜性降低,行为绝望等。2.M组大鼠海马组织内的DA含量相对C组显著降低,SA组大鼠海马内DA的含量相对于M组则明显提高,C组与SA组之间无显著差别。3.定量蛋白质组学结果显示应激前后共有391种蛋白发生了显著性差异表达,接受应激刺激的大鼠在服用SA后有82种蛋白表达有显著性差异。包括PRRT2在内的15种蛋白的表达量不仅在刺激前后而且在用药前后均发生了明显的差异性改变。4.Western Blotting结果显示M组大鼠海马组织内PRRT2含量相对C组显著降低,SA组大鼠海马内的PRRT2含量相对于M组则有显著性的提升。该结果与iTRAQ结果一致。5.400μM的皮质酮刺激能够显著抑制PC12细胞的增殖、降低细胞的成活率,5μmol的SA则能够显著地减轻皮质酮对PC12增殖的抑制作用,提高细胞成活率,减轻皮质酮刺激对PC12的损伤作用。6.皮质酮刺激能够下调PC12细胞内PRRT2的表达量,5μmol的SA具有上调PRRT2的趋势。结论:1.长期的慢性不可预知性应激能够降低海马组织内的DA含量,进而引起一系列抑郁样症状。2.SA可以上调DA含量,缓解抑郁样症状,具有较明显的抗抑郁效果。3.PRRT2参与调控突触囊泡的融合和释放过程,该蛋白能够促进DA等神经递质的快速释放过程,其表达量的降低会减少神经递质的释放量。因此我们推断,SA可能是通过上调PRRT2的表达量来促进DA的释放,从而发挥抗抑郁作用。4.SA可减轻应激刺激对神经细胞的损伤,具有一定的神经细胞保护作用。
【图文】：

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１邋ＣＵＭＳ成功诱导大鼠抑郁样行为逡逑１．１大鼠抑郁模型制备过程流程图逡逑图１Ａ是实验动物的分组和处理情况示意图，４５只大鼠被随机分为３组：逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋组（Ｃ邋组，１５）、ＣＵＭＳ邋组（Ｍ邋组，１５）、ＣＵＭＳ＋ＳＡ邋组（ＳＡ邋组，１５）。逡逑其中Ｃ组大鼠正常合笼饲养（５只／笼），Ｍ组和ＳＡ组大鼠接受为期８周的逡逑慢性应激刺激。在整个实验过程的第５周时ＳＡ组给予ＳＡ灌胃治疗，Ｍ组逡逑和Ｃ组给予同等体积（２ｍｌ）的生理盐水。图１Ｂ是制备大鼠抑郁模型的流逡逑程图，整个模型制备过程共需１０周。第１周适应性饲养；第２－９周进行慢逡逑性应激刺激，在第５周时给予ＳＡ灌胃治疗，治疗的同时刺激并不停止；第逡逑１０周进行行为学测试，测试结束后处死实验动物，分离海马组织。逡逑Ａ逦逦逦邋逦邋逦逦＾逦ＣＵＭＳ（－）逡逑￣￣＞逦ｓａ（－）逡逑Ｓａｌｉｎｅ（＋）逡逑＾邋（４５）逦１邋Ｓａｌｉｎｅ（Ｖ）逡逑＼＾ＣＵＭＳ＋ＳＡ＾Ｎ逦邋ＣＵＭＳ（＋）逡逑Ｖ＾＿（ＳＡ

差异表达,富集,大鼠

ＫＥＧＧ邋Ｐａｔｈｗａｙｓ邋（Ｔｏｐ邋２０）逡逑图５Ｂ邋Ｍ／Ｃ差异表达蛋白的ＫＥＧＧ通路富集分析逡逑图５Ｂ：邋Ｍ组大鼠和Ｃ组大鼠海马组织内差异表达蛋白的ＫＥＧＧ通路富集分逡逑析结果（Ｃ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋组，Ｍ：邋ＣＵＭＳ邋组）。逡逑Ｆｉｇ．５Ｂ：邋Ｔｈｅ邋ＫＥＧＧ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋Ｍ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋Ｃ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑４．２筛选出８２种可能受ＳＡ调控的蛋白逡逑同样利用ｉＴＲＡＱ技术，在Ｍ组和ＳＡ组之间共筛选出４７７５种差异表达蛋白。逡逑按照变化倍数＞１．２倍且ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５的标准，，进一步筛选出８２种蛋白在Ｍ逡逑组和ＳＡ组之间发生了显著性地差异表达。这些蛋白中有２３种表达量增加，逡逑５９种表达量下降。其具体信息见于附表２。Ｇｏ注释富集分析显示这８２种蛋逡逑白在细胞组分方面主要参与构成细胞膜、细胞器、突触和突触的部分结构等；逡逑在分子功能方面这些蛋白具有结合绑定功能、催化活性、核酸绑定功能和转逡逑录因子活性等；在生物学过程方面主要参与调控细胞进程、应激反应过程和逡逑生物新陈代谢过程等。ＧＯ注释富集分析的详细信息见于图５Ｃ。鉴定出的８２逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】