肝能滴丸质量标准及其有效成分抗肝纤维化初探

发布时间：2020-05-28 00:27

【摘要】：肝能滴丸(Ganneng Dripping Pills,GDP)是由藏药波棱瓜子的有效部位——波棱总木脂素(the total lignans of Herpetospermum caudigerum,TLHC)作为原料制成的滴丸剂,具有清利湿热、清热解毒的功效,能够保肝降酶、抑制乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)的复制,主治慢性肝炎。现代研究表明,TLHC能明显下调转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达,能显著降低透明质酸(HA)和羟脯胺酸(HYP)的含量,抑制肝纤维的合成与沉降,具有良好的抗肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)的作用。肝能滴丸现有的质量控制仅以薄层鉴别和herpetrione定量测定为主,检测指标单一,不能全面控制肝能滴丸的质量,保证药效。课题组前期建立了同时检测波棱瓜子药材中7种木脂素类成分的HPLC方法,但是由于对照品缺乏、制备困难等原因未能得到推广。近年来,指纹图谱与一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS)的结合,不仅能全面反映药物质量,还能通过单一对照品实现多成分同时测定,有效的解决了对照品昂贵、匮乏的问题,具有便利、快速、廉价等特点,已经被普遍应用于多种中药。本论文以肝能滴丸质量标准的研究为目标开展以下研究:首先,采用高压制备法对肝能滴丸有效部位TLHC进行分离纯化,采用面积归一化法对纯化后样品进行纯度检测,并通过UV、IR、NMR、MS等数据对获得的单体成分进行鉴定。从TLHC中制备8个化合物,经鉴定分别是dehydrodiconiferyl alcohol(BLG-3)、herpetotriol I(BLG-4)、herpetolide A(BLG-5)、herpetrione(BLG-6)、herpetin(BLG-7)、herpetetrone(BLG-10)、herpetone(BLG-11)、herpetenone(BLG-12),其中herpetotriol I为新化合物。其次,对肝能滴丸质量标准的研究。以herpetrione为指标成分,采用TLC进行定性鉴别,可见供试品与对照品在相同的位置上有同种颜色的斑点,而阴性样品无干扰。根据《中国药典》2015年版四部通则0108丸剂项下相关要求,对肝能滴丸进行重量差异、溶散时限和微生物限度的检测,检测结果均达到药典要求。以herpetrione为内参物,建立同时测定8个成分(dehydrodiconiferyl alcohol、herpetotriol I、herpetolide A、herpetrione、herpetin、herpetetrone、herpetone、herpetenone)的QAMS定量测定方法,并对5批肝能滴丸进行检测,方法稳定可靠。建立了肝能滴丸指纹图谱,通过《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》,对5批肝能滴丸指纹图谱进行相似度分析,采用中位数生成5批肝能滴丸指纹图谱的共有模式,并确定了14个共有峰,经过与对照品的对比,指认出8个成分,5批肝能滴丸相似度均在0.99以上。最后,根据肝能滴丸含量测定结果,选择含量较高的herpetrione和herpetone作为研究对象,采用CCK-8法检测不同浓度的herpetrione、herpetone对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)不同处理时间的影响,并采用流式细胞术对HSC-T6的凋亡率进行检测。结果表明,herpetrione、herpetone对HSC-T6增值抑制作用明显,呈浓度与时间依赖性;细胞凋亡率分别随着herpetrione、herpetone浓度的增加而增大。说明herpetrione和herpetone具有抗肝纤维化的作用。
【图文】：

流程图,制备流程,纯度,质量

1.2.2 化学成分提取、分离取 TLHC 约 30 g，加入 600 ml 甲醇，超声溶解，滤过。采用高压制备液相分离纯化，色谱柱为 Innoval ODS-2 10um 100A，流速为 80 ml·min-1，检测波长为 280 nm，辅助波长为 254 nm，流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，共接收 8 个组分 A~H，再经反复高压制备方法，得到单体化合物。采用面积归一化法对各单体的纯度进行标定，各成分纯度及质量分别为：BLG-3，纯度为95.2%，质量为 33.2 mg；BLG-4，纯度为 93.1%，质量为 120.2 mg；BLG-5，纯度为 94.6%，，质量为 244.0 mg；BLG-6，纯度为 98.7%，质量为 1.99 g；BLG-7，纯度为 95.9%，质量为 261.7 mg；BLG-10，纯度为 95.4%，质量为38.7 mg；BLG-11，纯度为 98.6%，质量为 270.0 mg；BLG-12，纯度为 96.5%，质量为 251.2 mg。分离制备流程图，见图 1-1；高压制备色谱图，见图 1-2。

薄层色谱,滴丸,薄层色谱

成都中医药大学 2018 届硕士学位论文开剂烷-乙酸乙酯-甲醇（3:2:0.2）。层鉴别色谱法（《中国药典》2015 版四部通则 0502）项下的方”“ 2.2.1.2”“ 2.2.1.3”项下的对照品溶液、供试品溶，分别点于同一硅胶薄层板上，用“2.2.1.4”项下展开剂喷以 20%硫酸乙醇溶液，在 110℃加热至斑点显色清晰批次供试品中在与对照品谱图相同的位置上有同一颜色。见图 2-1。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R286.0;R285

【参考文献】