蒺藜甾体皂苷成分TTS-12及其制剂抗皮肤癣菌的内体外活性研究

发布时间：2020-05-28 01:02

【摘要】：目的;通过多个指标验证TTS-12对皮肤癣菌的抗真菌活性,初步探究TTS-12的抗皮肤癣菌机制,通过体外抗真菌药物诱导的方式建立皮肤癣菌耐药模型,并考察TTS-12对耐药皮肤癣菌的体外抗真菌作用,通过感染氟康唑耐药皮肤癣菌豚鼠模型来考察TTS-12的体内抗菌活性。方法:1.运用CLSI的M38-A2方案测定TTS-12对两种常见皮肤癣菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并考察TTS-12对皮肤癣菌菌丝生长、孢子萌发及总生物量的影响,通过棋盘法测定TTS-12与常用抗皮肤癣菌药物联合使用的抗真菌效果。2.通过HPLC-UV检测TTS-12对红色毛癣菌细胞膜中麦角固醇的合成量影响,并考察TTS-12对细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶两种酶活性的影响。3.通过体外浓度递增法建立皮肤癣菌耐药模型,考察耐药模型的稳定性并测定TTS-12对耐药皮肤癣菌的抗菌活性。4.建立豚鼠感染耐氟康唑红色毛癣菌模型,给予1%的TTS-12凝胶,观察TTS-12对病变皮肤的改善效果,探讨TTS-12凝胶对豚鼠感染耐药红色毛癣菌体癣模型的影响。结果:1.蒺藜TTS-12对红色毛癣菌标准株的MIC值为2μg×mL~(-1),MFC为16μg×mL~(-1),对27株临床菌株的MIC范围为1~8μg×mL~(-1),对须癣毛癣菌标准株MIC为1μg×mL~(-1),MFC为8μg×mL~(-1),对27株临床菌株的MIC范围为0.5~8μg×mL~(-1)。对真菌的菌丝生长、孢子萌发和生物量菌均有呈浓度依赖性的抑制作用,并且与特比萘芬联合使用时,对两种皮肤癣菌的标准菌株FIC0.5,对临床菌株FIC0.5的比例为81.5%和76.2%。2.建立了HPLC-UV检测麦角含量的分析方法,TTS-12的浓度越高,其抑制红色毛癣菌中麦角甾醇合成作用越大,且TTS-12能够抑制线粒体中琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性,呈剂量依赖性。3.利用体外浓度递增法建立了红色毛癣菌抗氟康唑和酮康唑模型,两种模型分别对两种药物的MIC范围为128~512μg×mL~(-1)和64~128μg×mL~(-1)。经过多次传代仍保持耐药性。TTS-12对两种的MIC依旧处在较低水平,其范围在4~16μg×mL~(-1)和4~8μg×mL~(-1)。4.建立了豚鼠感染耐氟康唑红色毛癣菌体癣模型,与模型组相比,含量为1%的酮康唑和TTS-12凝胶均对感染有一定改善作用,且TTS-12的改善作用要高于酮康唑。HE和PAS染色结果显示,模型组相比,TTS-12组炎性细胞浸润情况轻,且角质层较为正常,棘层基本没有增厚。结论:1.蒺藜TTS-12对红色毛癣菌和须癣毛癣菌的标准菌株及临床菌株都具有良好的体外抗真菌活性,能够抑制两种皮肤癣菌的孢子萌发率、菌丝生长,且与特比萘芬联用具有良好的协同作用。2.TTS-12抗皮肤癣菌的机制可能为影响麦角固醇的合成通路,减少其合成量,影响细胞膜的完整性,并影响线粒体中呼吸作用的限速酶,从而影响细胞功能导致细胞死亡。3.TTS-12对于氟康唑、酮康唑耐药的红色毛癣菌具有良好的抑菌活性,并且TTS-12凝胶对感染耐氟康唑红色毛癣菌豚鼠模型也有良好的治疗作用,说明TTS-12具有一定体内抗耐氟康唑皮肤癣菌的作用。
【图文】：

测 TTS-12 对红色毛癣菌线粒体中苹果酸脱氢酶（MDH）活力的按照试剂一:试剂二:试剂三=60:1:5 的比例进行配制，现配现用见分光光度计调于 340 波长处，用 1cm 光镜比色皿，以蒸馏入 100μL 线粒体蛋白样品，迅速转移 2.6mL 工作液至试管中混合液迅速倒入比色皿中，在 340nm 处比色，5 秒时读取吸光第 65 秒时测吸光值（A2）。求出两次吸光度差值△A=A1—A2公式同 3.3.2.3 SDH 酶活性的定义和计算。结果12 对红色毛癣菌麦角固醇合成的影响效液相色谱图醇对照品的图谱如图 3-1 所示，在红色毛癣菌中提取的麦角固示，两者的峰型一致，保留时间约在 10.67min 左右。

图 3-2 红色毛癣菌中提取的麦角固醇高效液相色谱图g3-2 The HPLC chromatography ofergosterol extracted from T.rub准曲线积 Y 为纵坐标，进样浓度 X 为横坐标，进行线性回归，得到回归+44.381，r=9997。结果说明麦角固醇进样量在 24～624μg mL-1有。TS-12 对麦角甾醇含量的影响0.30.40.5contenti（%）***********
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285

【参考文献】

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本文编号：2684446