溃结灵对UC大鼠NLRP3炎性体相关通路的调控研究

发布时间：2020-05-28 21:46

【摘要】：目的:溃疡性结肠炎(UC)是一种以慢性复发性泄泻为主要症状的胃肠道疾病,其特征是慢性炎症、腹痛、直肠出血、腹泻和营养不良。近年来多项研究表明细胞内的Nod样受体P3(NLRP3)是维持肠道内稳态的关键,与UC的发病有关。前期本团队的研究表明,溃结灵对UC具有良好的疗效。本研究以NLRP3为切入点,进一步研究溃结灵治疗溃疡性结肠大鼠所具有的作用。内容:1.溃结灵对UC大鼠重量、结肠长度、结肠质量及病理学形态的影响炎性肠病主要有两种类型:溃疡性结肠炎和克罗恩病,它是由于肠道免疫系统失调而造成的一种慢性、复发性、持续性炎症性疾病。建立大鼠UC模型,采用溃结灵进行治疗,观察大鼠在以下方面的变化:大鼠重量、结肠长度、质量、病理学形态,评估溃结灵治疗TNBS诱导的UC大鼠所具有的作用。方法:将60只SD大鼠随机分为六组:正常组、模型组、溃结灵高剂量组、溃结灵中剂量组、溃结灵低剂量组和柳氮磺砒啶(SASP)组,每组10只。除正常组外,其余各组予三硝基苯磺酸灌肠构建UC模型,并分别给予水,高、中、低剂量溃结灵和柳氮磺吡啶进行灌胃10天。给药结束后后观察UC大鼠在以下方面的变化:大鼠体重、结肠长度、质量、及病理学形态。结果:溃疡性结肠炎模型大鼠的结肠长度明显缩短(P0.01),结肠质量明显增加(P0.01),体重减轻;与模型组比较,溃结灵治疗组和柳氮磺砒啶组结肠长度不同程度增加(P0.01),结肠质量明显下降(P0.05),体重增加。病理结果显示模型组结肠组织固有层崩解,血液渗出、溃疡形成,毛细血管管径增大、血液充盈明显,可见大量急慢性炎症细胞浸润于肌层及外膜内。溃结灵组和柳氮磺砒啶组以上变化较模型组减轻明显(P0.05)。2.溃结灵对UC大鼠结肠黏膜NLRP3、caspase-1、ASCmRNA表达的影响NLRP3炎性体是一种信号复合物,此信号复合物是由NLRP3调节caspase-1的激活所形成的。NLRP3炎性体由NLRP3、ASC和caspase-1三部分组成。病原相关分子模式使NLRP3激活,促进caspase-1依赖的pro-IL-1β、pro-IL-18、pro-IL-33的生成,从而使这些分子的活性形式得以分泌和释放。方法:动物造模、分组和给药同实验一。采集大鼠结肠粘膜,进行充分匀浆,柱式法提取总RNA。采用荧光定量PCR法检测大鼠结肠黏膜中NLRP3、caspase-1、ASCmRNA的含量,并对结果进行统计学分析。结果:模型组大鼠结肠粘膜中NLRP3、caspase-1、ASC的mRNA表达显著增高(P0.01或0.05);溃结灵高、中、低剂量组和柳氮磺砒啶组NLRP3、caspase-1、ASC mRNA表达均显著减少(P0.01或0.05)。3.溃结灵对UC大鼠结肠黏膜NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达所产生的影响通过观察溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜NLRP3相关蛋白表达的影响,探讨相关治疗机制。方法:动物造模、分组和给药同实验一。提取结肠粘膜总蛋白,采用BCA法测定蛋白含量。随后采用Western blot法检测大鼠结肠黏膜中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白的相对表达量,并将结果进行统计学分析。结果:模型组大鼠结肠粘膜中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达高于正常组(P0.05)溃结灵高、中剂量组和柳氮磺吡啶组此种增高趋势明显改善(P0.05),溃结灵低剂组NLRP3、caspase-1、ASC蛋白相对表达量有下降趋势,但无统计学意义(P(29)0.05)4.溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜IL-1β、IL-18、IL-33含量的影响NLRP3激活后,其寡聚化结合了PYD结构域与ASC的PYD结构域,并通过CARD区域募集procaspase-1使得Caspase-1活化。活化的caspase-1能对pro-IL-1β、pro-IL-18、pro-IL-33进行剪切,使其形成具有生物活性的成熟细胞因子从而参与肠道免疫反应和炎症过程,它们在溃疡性结肠炎的发生与发展过程中起着关键作用。方法:动物造模、分组和给药同实验一。采集大鼠结肠黏膜样本,检测大鼠结肠粘膜中IL-1β、IL-18、IL-33的含量采用酶联免疫吸附法。结果:模型组大鼠结肠粘膜中IL-1β、IL-18、IL-33的含量明显高于正常组(P0.01),溃结灵高、中、低剂量组和SASP组结肠粘膜中IL-1β、IL-18、IL-33的含量明显低于模型组(P0.05或P0.01);结论:实验结果表明,在TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠中,炎症的发展可能与大鼠结肠粘膜的NLRP3、caspase-1、ASC的蛋白和mRNA的表达升高,NLPR3炎性体被激活,及其下游相关炎症因子IL-1β、IL-18、IL-33的表达升高有关。本实验以溃结灵对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎进行给药治疗,大鼠的结肠长度和病理形态结果提示溃结灵能缓解TNBS所致的溃疡性结肠炎。其作用机制可能与溃结灵下调大鼠结肠粘膜中NLRP3、caspase-1、ASC的蛋白和mRNA的表达,并抑制其下游相关炎症因子IL-1β、IL-18、IL-33的表达有关。
【图文】：

结肠,溃疡性结肠炎,长度,柳氮磺吡啶

24.2322.8819.78*26.02*27.61**柳氮磺吡啶10 0.5212.0014.39216.5018.19218.9020.65232.1033.45243．4036.27*与模型组比较*P㩳0.05， **P㩳0.012.1.3.2 结肠长度及质量由表 2 可见，与正常组比较，模型组结肠长度明显缩短(P<0.01)；与模型组比较，溃结灵高中低剂量组和柳氮磺砒啶组结肠长度明显增加(P<0.01)。与正常组比较，模型组结肠质量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，结灵溃结灵高中低剂量组和柳氮磺砒啶组结肠质量下降(P<0.05)。表 2 溃结灵对结肠长度和结肠质量的影响( ±S)组别 n剂量(g/kg) 结肠长度 cm 单位结肠质量（g/cm）正常组 10 - 15.40 0.77** 1.27 0.14**模型组 10 - 12.75 1.74 4.29 1.72溃结灵 10 18．3 14.69 1.01** 1.64 1.15**溃结灵 10 9.2 14.21 0.65** 2.58 2.19*溃结灵 10 4.6 14.05 1.36** 2.75 1.89*柳氮磺吡啶 10 0.5 14.07 0.53** 2.64 1.96*与模型组比较*P㩳0.05， **P㩳0.01

溃疡性结肠炎,病理组织学,大鼠,动物模型

溃结灵中剂量组(9.2g/kg)溃结灵低剂量组(4.6g/kg)柳氮磺吡啶组(0.5g/kg)图 2 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理组织学的影响（HE 100）2.1.4 讨论溃疡性结肠炎是一种消化道疾病，此疾病病因不明，主要侵犯直肠和乙状结肠（可延伸至降结肠、横结肠、少数可累及全结肠），粘膜和粘膜下层的浅表性、非特异性炎症。近年来随着社会的进步，经济水平的不断提高，UC 在我国和世界范围内的发病率均显示出了上升的趋势。因尚未研究出疾病发生的确切病因和机制，而治疗的关键是阐明疾病发生的分子机制。由于应用人体作为实验的对象有着诸多方面的局限，研究并成功制备与人类疾病相似或等同的溃疡性结肠炎动物模型尤为重要，也是研究该病病因、发病机理、开发有限药物和采取各种治疗手段的前提。目前国内外研究溃疡性结肠炎动物模型，大致包括四类：免疫法诱导的动物模型、化学法诱导的动物模型、人类β 微球蛋白转基因模型和小鼠 HLA-B27、根据中医证型建立的动物模型。随着对免疫学的深入研究，目前该病较公认的发病机制是免疫的异常，，采用免疫法制备的溃疡性结肠炎动物模型，在发病机制上更加接近本病的发病原
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】