基于计算机辅助设计筛选具有抗流感病毒神经氨酸酶活性的中药单体化合物

发布时间：2020-05-29 00:53

【摘要】：流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病,每年都会给人类健康造成严重威胁,给世界经济带来巨大负担。目前针对流感的研究主要集中在研发广谱流感疫苗和抗流感药物方面。抗流感药物一直是治疗流感的重要有效途径。但近年来流感病毒耐药性有所增加,并且耐药流感病毒株能够在全世界传播,这使得解决流感病毒的耐药性成为研究抗流感病毒药物的重点和热点。中医抗流感历史悠久,积累的大量行之有效的抗流感中药和中药复方。中药具有不同于西药的抗流感方式,中药和中药复方往往能够作用于流感病毒复制过程中的多个靶点,并且很多中药能够通过调节机体免疫力来治疗流感。这使得运用中药解决流感病毒的耐药性成为可能。同时,鉴于神经氨酸酶(NA)在流感病毒的整个复制过程中发挥重要作用,而中药能有效治疗流感,这提示我们中药中可能有抑制NA的成分。但目前对于中药和中药复方的研究主要集中于抗流感的作用效果,对其抗流感机制和发挥抗流感作用的成分研究较少。此外,中药和中药复方的抗流感药效较之西药奥司他韦等还有待提高。目前,流感病毒对现有药物的耐药性也是亟待解决的问题。联合用药是解决耐药性出现、降低药物的用量、提高临床疗效并且降低药物毒副作用的有效手段。基于以上考虑,本论文研究的主要思路是:从清热解毒解表类中药单体化合物中筛选流感病毒神经氨酸酶抑制剂,并通过与奥司他韦联合来降低病毒对神经氨酸酶抑制剂(NAI)的耐药性,并且提高中药单体化合物的疗效。在本论文主要研究以下两部分内容:1.从清热解毒解表类中药单体化合物文库中筛选NAI并分析其与NA的相互作用首先从蛋白质数据库中检索两类经典甲型流感病毒NA类型(N1,N2)的三维晶体结构。通过Discovery Studio 3.5软件将所有的NA蛋白质3D结构去水、去杂原子等以备接下来的实验所用。随后,建立清热解毒解表类中药单体化合物文库。在台湾中国要数据库(TCMs)中,下载发散风寒型解表类中药防风、苍耳子、辛夷等16种;发散风热型解表类中药菊花、升麻、浮萍等12种;清热解毒类中药板蓝根、白头翁、金荞麦等31种。通过TCMs数据库检索这59种清热解毒解表类中药的单体成分共2981个,下载其三维构象,组成小分子化合物文库。最后,利用AutoDock4.2软件,以N1,N2为靶点,分别对小分子数据库进行虚拟筛选。通过结合能打分排序,获得候选化合物,以用于后续酶学实验。采用底物荧光法检测候选中药单体化合物对N1和N2的抑制活性。通过实验得到了各个候选中药单体化合物对N1和N2抑制的IC50值,其中中药单体化合物1、中药单体化合物2、中药单体化合物3、中药单体化合物4和中药单体化合物5这五种中药单体化合物对N1和N2的抑制效果较好,IC50值均小于200μM。并用AutoDock4.2软件将中药单体化合物1和中药单体化合物2分别与N1和N2进行分子对接,分析中药单体化合物1和中药单体化合物2与NA之间的相互作用,结果表明中药单体化合物1和中药单体化合物2与NA之间的相互作用包括氢键、疏水相互作用以及静电相互作用。2.中药单体化合物1和中药单体化合物2分别与奥司他韦联合对NA的抑制作用及机制分析两种或两种以上的药物联合使用,能够解决流感病毒的耐药性问题,并且有提高抗流感药物的临床疗效、降低药物副作用的功效。因此,用联合用药的方式研究中药单体化合物1和中药单体化合物2分别与奥司他韦联合对NA的抑制效果并用联合用药软件CalcuSyn2.0分析两种药物联合的作用效果。实验结果显示中药单体化合物1与奥司他韦联合对N1和N2抑制的CI值均小于1,说明两种药物联合对N1和N2的抑制呈现协同作用。中药单体化合物2和奥司他韦联合对N1的抑制也呈现协同效果,但两者的联合对N2的抑制却呈现拮抗作用。此外,这两种药物与奥司他韦联合的剂量减小指数(DRI)值均大于1,这表明两种药物联合之后达到特定抑制效果的剂量均减少,说明两种药物联合之后的疗效均有所提高,有利于降低药物的毒副作用。在蛋白数据库中找到结合奥司他韦的NA(N1,N2)晶体结构,然后利用AutoDock4.2软件将中药单体化合物1分别与结合奥司他韦的N1和N2对接,分析三者之间的相互作用。分子对接结果显示,中药单体化合物1和奥司他韦联合之后与NA的氢键相互作用增加,这可能是两者联合对NA的抑制起到协同作用的原因。通过本研究,筛选出了两种对N1和N2抑制效果较好的中药单体化合物中药单体化合物1和中药单体化合物2。证实了中药单体化合物1与西药奥司他韦联合对N1和N2的抑制呈现协同效果,并且能够降低每种药物的使用剂量,减少药物毒副作用,提高疗效。本研究从中药单体化合物与西药联用对流感病毒关键酶NA的协同作用角度阐述中药的作用效果和作用机制,为中西医结合治疗流感的临床应用提供理论依据。
【图文】：

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感冒简称流感，是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病 5% - 10%的人口会感染流感病毒。在非危险个体中，流感通吸道感染。但对于 2 岁以下的儿童、孕妇以及老年人和其它严毒往往会引起严重的肺损伤、肾功能衰竭和急性呼吸系统疾，甚至会导致死亡。65 岁以上的老年人患流感的死亡率最高传染性很强，很容易造成世界范围内的大流行。每次流感大万到上百万人死亡。大流行过后，流感病毒株毒力减弱，转化在人群中传播。据世界卫生组织和美国疾控中心统计，季节性围内造成约 300 万至 500 万严重病例，29 万至 65 万例死亡。的监测显示,2018 年整体的流感流行水平明显高于往年,是近为严重的一次。

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图 1.2 NA 和 NAI 的作用原理图 1.3 神经氨酸酶抑制剂作用效果。 A：未加入 NAI，病毒粒子正常释放。B：加入 NAI，子代病毒粒子发生聚集。表 1.1 NAI 的抑制效果Inhibitor Inhibition (IC50, nmol/L)
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;TP311.13

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