五味子乙素对缺血再灌注致急性肾损伤的影响及其可能机制

发布时间：2020-05-29 10:05

【摘要】：目的:体内外共同观察五味子乙素(schisandrin B,Sch B)对肾缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)致急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:1、体内实验:将雄性的45只C57BL/6小鼠随机性的分成3组,15只/组,即假手术组(Sham组)、模型组(即缺血再灌注组,I/R组)与五味子乙素预保护组(Sch B+I/R组),Sham组与I/R组小鼠在建模前用橄榄油(2 ml/kg)连续灌胃7天,Sch B+I/R组小鼠在建模前用Sch B[80 mg/(kg·d)]连续灌胃7天,构建肾缺血再灌注模型所选用的方法为双侧肾蒂夹闭法,于再灌注后的第1、2、7天各组按随机数字表法选取5只小鼠,取小鼠眼眦内静脉血检测血肌酐(serum creatinine,Scr)与血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);HE染色与糖原PAS染色观察小鼠肾组织所发生的损伤情况;RT-PCR检测肾组织中NGAL、Kim-1肾损伤相关m RNA的表达量;Western blot检测肾组织中caspase-3、Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白及LC3自噬相关蛋白的表达量;TUNEL染色法检测肾组织内小管上皮细胞所发生的凋亡情况。2、体外实验:随机性将体外培养的肾小管上皮细胞(HK-2)分为对照组、缺氧/复氧组(Hypoxia/Reoxygenation,H12/R6h、H12/R12h、H12/R24h)、Sch B+H/R组(Sch B+H12/R6h、Sch B+H12/R12h、Sch B+H12/R24h),Sch B+H/R组首先用Sch B预孵育6h后再行缺氧/复氧处理,CCK8试剂盒检测各组HK-2细胞的活性,Western blot所需检测的蛋白同体内实验,Annexin-V/PI染色检测HK-2细胞的凋亡率。结果:1、体内实验:血Scr与血BUN结果显示,第1、2天,与Sham组比较,Sch B+I/R组血Scr与BUN水平均显著升高,与I/R组比较,Sch B+I/R组血Scr与BUN水平均显著降低;I/R组与Sch B+I/R组血Scr与BUN水平均在第1天最高,第2、7天则逐渐下降,且在第7天已恢复正常水平。HE染色结果显示,Sham组小鼠肾组织的结构未见明显改变;I/R组小鼠肾组织间质可见大量炎性细胞的浸润,小管损伤明显加重等;而Sch B+I/R组病变明显轻于I/R组,且I/R组与Sch B+I/R组肾组织均在第1天损伤最重,第2、7天则逐渐减轻。糖原PAS结果显示,Sham组肾组织结构未发生改变;I/R组肾组织内肾小球系膜细胞出现增生,且有PAS阳性染色物质的沉积,小球上的血管壁发生非均匀性的增厚;Sch B+I/R组肾组织所出现的病理改变则是明显较I/R组轻,且I/R组与Sch B+I/R组肾组织均在第1天发生的病理改变最重,第2、7天则逐渐减轻。RT-PCR结果显示,第1、2天,与Sham组比较,I/R组与Sch B+I/R组肾组织中Kim-1、NGAL m RNA水平均显著升高,且I/R组上升更为显著;I/R组与Sch B+I/R组肾组织中Kim-1、NGAL m RNA水平均在第1天最高,第2、7天则逐渐下降。Western blot结果显示,在第1、2天,与Sham组比较,I/R组与Sch B+I/R组肾组织中caspase-3、LC3蛋白表达明显升高,Bcl-2/Bax值明显降低;而与I/R组相比,Sch B+I/R组caspase-3蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值、LC3蛋白表达增多;在第7天三组肾组织中相关蛋白的表达已无差别。TUNEL染色结果显示,与Sham组相比,I/R组与Sch B+I/R组中凋亡指数均明显的升高,而I/R组凋亡指数明显高于Sch B+I/R组,且I/R组与Sch B+I/R组均在第1天凋亡指数最高,第2、7天则逐渐降低,在第7天与Sham组已无差别。2、体外实验:CCK8结果显示,H/R组与Sch B+H/R组的细胞活性均出现明显的下降,但Sch B+H/R组较H/R组的细胞活性是增长的,且随复氧时间的延长,各组细胞活性逐渐增多;Western blot结果显示,与对照组相比,H/R组与Sch B+H/R组HK-2细胞中LC3蛋白表达明显升高、Bcl-2/Bax值明显降低,与H/R组相比,Sch B+H/R组LC3水平与Bcl-2/Bax比值均上升,且随复氧时间的延长,两组LC3水平下降、Bcl-2/Bax值上升;Annexin-V/PI染色结果显示,与对照组相比,H/R组与Sch B+H/R组细胞凋亡率均上升,但H/R组上升更为显著,且随复氧时间的延长,两组细胞凋亡率均减少。结论:体内实验中,C57BL/6小鼠夹闭双侧肾蒂40min能够成功诱导出I/R所致的AKI模型,Sch B对缺血再灌注致AKI小鼠的肾功能、病理损伤及细胞凋亡情况有一定的改善作用;Sch B对缺氧/复氧造成HK-2细胞的死亡有一定保护作用,其可能与调节凋亡相关因子caspase-3、Bcl-2、Bax与自噬相关因子LC3有关,且在AKI的早期Sch B所发挥的保护作用更为显著。
【图文】：

小鼠,组内

图 1 小鼠 I/R 后各组血 Scr 与 BUN 值的比较（ x±s,n=5）小鼠 I/R 后各组血 Scr 值的统计结果；（B）小鼠 I/R 后各结果。与 Sham 组相比，，##P<0.01#P<0.05；与 SchB+I/R 组相5。表 2 组内各组血 Scr 与 BUN 值的比较（ x±s,n=5）时间（天）鼠数（只） Scr（mg/dl） BU 组第 1 天 5 0.263±0.058 34第 2 天 5 0.252±0.043 33第 7 天 5 0.257±0.051 33组第 1 天 5 1.676±0.028 99第 2 天 5 0.556±0.075&&97.1第 7 天 5 0.313±0.075Φ39.8I/R 组第 1 天 5 0.749±0.132 54第 2 天 5 0.389±0.044&&45.4第 7 天 5 0.262±0.099Φ33.

肾组织,小鼠,HE染色,组内

图 2 小鼠 I/R 后各组肾组织学的改变）HE 染色观察小鼠 I/R 后各组肾组织学的改变（40×）；（B）H织损伤评分的统计结果（ x±s,n=5）。与 Sham 组相比，##P<0.01+I/R 组相比，**P<0.01 *P<0.05。表 3 组内各组肾组织损伤评分（分）的比较（ x±s,n=5）组别时间（天）鼠数（只）损伤评am 组第 1 天 5 0.700±0第 2 天 5 0.727±0第 7 天 5 0.909±0/R 组第 1 天 5 11.600±1第 2 天 5 7.133±0.8第 7 天 5 3.500±0.8+I/R 组第 1 天 5 6.846±1第 2 天 5 5.333±1.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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