白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响及机制研究

发布时间：2020-05-30 09:47

【摘要】：目的:探讨白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响及其可能分子机制。方法:体外培养小鼠NIH3T3细胞。(1)探讨不同浓度白藜芦醇对饥饿24h的NIH3T3细胞活力的影响。实验分为3组:对照组(Ctrl),白藜芦醇组(白藜芦醇0.1、0.5、1、5、10、20、40、80μmol/L,Res0.1、Res0.5、Res 1、Res5、Res 10、Res 20、Res 40、Res 80),空白组(Blank)。(2)探讨Shh信号通路在白藜芦醇影响NIH3T3细胞活力中的作用。实验分为5组:对照组(Ctrl),白藜芦醇组(Resl),Shh信号通路Smo受体抑制剂环王巴明组(cyclopamine,Cyc),白藜芦醇+环王巴明组(Resl+Cyc),空白组(Blank)。(3)探讨Sirt1是否影响Shh信号通路。实验分为6组:对照组(Ctrl),白藜芦醇组(Res1),Sirt1 激动剂 SRT1720 组(SRT),Sirt1抑制剂Sirtino1组(Sirtino1),重组小鼠Shh蛋白组(Shh),空白组(Blank)。CCK-8法测定细胞活力,免疫细胞化学染色观测Gli-1蛋白的核移位,Smo蛋白移位到初级纤毛。Western blotting检测信号通路Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白的表达。结果:1.白藜芦醇对NIH3T3细胞活力影响的浓度效应CCK-8 法显示 0.5 和 1 μmol/L 白藜芦醇组(0.679 ± 0.047,0.774 ±0.054)细胞活力分别较对照组(0.585 ± 0.039)明显增强(P0.01,P0.001),其中以1 μmol/L白藜芦醇组最强。之后随白藜芦醇浓度(10、20、40、80 μmol/L)的增高,细胞活力逐渐降低(0.428 ± 0.043,0.395 ±0.031,0.373 ±0.017,0.361 ± 0.016),且均较对照组明显减弱(P=0.000,P0.001,P= 0.001,P= 0.001),而 0.1 μmol/L(0.602 ± 0.065)和 5 μmol/L组(0.556 ±0.041)细胞活力与对照组比较无明显差异(P0.05,P=0.05)。选1μmol/L白藜芦醇组作进一步研究。2.Shh信号介导白藜芦醇影响NIH3T3细胞活力CCK-8法结果显示,lumol/L白藜芦醇组细胞活力(0.778±0.371)明显高于对照组(0.563±0.034)(P0.05)。而环王巴明组(0.439±0.259)或环王巴明联合白藜芦醇组(0.602±0.179)细胞活力明显低于白藜芦醇组,且环王巴明组最低(P0.05)。免疫荧光结果显示NIH3T3细胞存在一根初级纤毛。对照组Smo蛋白位于细胞浆,白藜芦醇组Smo蛋白从细胞浆进入初级纤毛,而环王巴明组或环王巴明联合白藜芦醇组,Smo蛋白仍位于细胞浆。同时对照组Gli-1蛋白主要表达于细胞浆,白藜芦醇组Gli-1蛋白则明显移位到细胞核,而环王巴明组或环王巴明联合白藜芦醇组,Gli-1蛋白仍位于细胞浆。Western blotting法显示白藜芦醇组Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相对表达明显高于对照组(P0.05),而环王巴明组或环王巴明联合白藜芦醇组Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相对表达明显低于白藜芦醇组,环王巴明组最低(P0.05)。3.Sirt1对NIH3T3细胞Shh信号的影响CCK-8 法结果显示,lumol/L 白藜芦醇(0.751±0.05),SRT1720(0.793±0.037)和Shh(0.838±0.418)组细胞活力明显高于对照组(0.531±0.034)(P0.05),而 Sirtinol 组(0.448±0.030)细胞活力明显低于对照、白藜芦醇、SRT1720和Shh组(P0.05)。免疫荧光结果显示对照组Smo蛋白位于细胞浆,白藜芦醇、SRT1720和Shh组Smo蛋白从细胞浆进入初级纤毛,而Sirtinol组,Smo蛋白仍位于细胞浆。同时,对照组Gli-1蛋白主要表达于细胞浆,白藜芦醇、SRT1720和Shh组Gli-1蛋白则明显移位到细胞核,而Sirtinol组Gli-1蛋白仍位于细胞浆。Western blotting 法显示白藜芦醇、SRT1720 和 Shh 组 Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相对表达明显高于对照组(P0.05),而Sirtinol组Shh、Ptc-1、Smo和Gli-1蛋白相对表达明显低于对照、白藜芦醇、SRT1720 和 Shh 组(P0.05)。结论:白藜芦醇能通过Shh信号介导以增强NIH3T3细胞活力,并且Sirt1可能是Shh信号通路上游的调节剂。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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