天然植物化合物土木香内酯对胶质母细胞瘤抑制作用的实验研究

发布时间：2020-05-31 16:00

【摘要】：目的:胶质母细胞瘤(GBM)恶性程度高,预后极差。土木香内酯(ATL)为半萜内酯类的天然植物化合物,体内代谢稳定,毒副作用少,具有潜在的抗肿瘤活性。第一部分实验旨在研究ATL对GBM增殖生长的影响,探究可能的分子机制;并验证ATL能否透过血脑屏障。第二部分研究ATL对GBM迁移侵袭及凋亡情况的影响,探究ATL作用的分子机制及调控靶点。方法:第一部分实验中,首先通过MTT法检测经不同浓度ATL处理人神经肿瘤细胞U87、U251、U118、SH-SY5Y及人正常胶质细胞SVG p12后的细胞活力;经ATL处理U87及U251细胞后,通过细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况,运用流式细胞仪对细胞周期进行检测,并采用Western Blot方法检测调控细胞周期进程关键蛋白的表达情况。在进一步的分子机制检测中,我们运用Western Blot、PCR、免疫荧光共聚焦技术,Pulldown以及染色质免疫共沉淀等方法,探究经ATL处理后,转录因子NF-κB p65/p50的核转位及p300的募集情况,以及它们与COX-2启动子区域结合力的影响。在探寻ATL作用靶点的研究中,本实验采用体外激酶实验及分子对接方法,验证ATL与IKKβ的相互作用。在体内实验研究中,采用异体裸鼠荷瘤实验,研究ATL在体内对肿瘤生长的情况的影响。采用免疫组化检测ATL对分子机制中关键蛋白表达情况的影响。另外检测ATL能否透过血脑屏障,我们予大鼠腹腔注ATL后,采用液相色谱-质谱联用的方法检测活体脑脊液中ATL的含量。第二部分实验中,首先采用划痕愈合实验及Transwell小室实验检测,经不同浓度ATL处理的人胶质母细胞瘤株U87、U251细胞的迁移侵袭能力。在分子机制研究中,运用Western Blot蛋白印迹、激光共聚焦免疫荧光技术,研究基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9的蛋白表达情况,Cofilin蛋白的活化情况,及G-actin与F-actin比例变化情况。另一方面采用流式细胞仪检测,经不同浓度ATL处理的U87、U251细胞的中凋亡细胞数的变化情况。在分子机制研究中,运用Western Blot蛋白印迹、激光共聚焦免疫荧光技术及蛋白质免疫共沉淀方法,研究Cofilin及Actin向线粒体转位情况,细胞色素C从线粒体向胞浆的释放情况,及Caspase级联通路中关键蛋白的表达情况。对ATL靶向作用于调控Cofilin的LIMK酶的研究中,运用预先加用特异性抑制剂LIMKi的方法,再分别检测迁移侵袭能力方面及凋亡方面的变化情况。在体内实验研究中,采用Western Blot蛋白印迹及免疫组化实验检测ATL对异体裸鼠荷瘤的肿瘤组织中p-cofilin及p-LIMK1/2蛋白表达的影响。结果:第一部分:ATL能显著抑制GBM细胞的增殖生长。其可能分子机制:ATL作用于IKKβ的ATP结合位点,遏制其磷酸化,从而抑制NF-κB的核内转位,阻碍NF-κB结合到COX-2的启动子区以及p300的募集,下调COX-2的基因表达,进而抑制GBM的增殖生长;而且ATL能下调Cyclin D1和CDK4的蛋白表达,阻滞GBM细胞周期循环在G0/G1期。在体内实验中也证实了ATL能够显著下调异体荷瘤组织中COX-2及p-p65的蛋白表达水平。另外经活体脑脊液检测发现,ATL能透过血脑屏障。第二部分:一方面ATL能够显著抑制GBM细胞的迁移侵袭能力,其分子机制可能为ATL能激活Cofilin的活性,上调G-actin与F-actin的比率;另一方面ATL能显著诱导GBM细胞的凋亡发生,其分子机制可能为ATL能激活Cofilin的活性,促使Cofilin与G-actin共转位至线粒体,介导细胞色素C向胞浆的释放,启动Caspase级联信号通路诱导凋亡发生。在调控靶点研究中,发现ATL是通过靶向抑制LIMK酶活性,从而活化Cofilin。在体内实验中发现ATL能够显著下调异体荷瘤组织中p-cofilin及p-LIMK1/2的蛋白表达水平。结论:第一部分实验,发现ATL通过靶向抑制IKKβ酶活性,干扰NF-κB/COX-2介导的信号通路,以及阻滞细胞周期循环,从而发挥抗GBM细胞增殖生长的作用。另外通过活体实验证实ATL能透过血脑屏障,为ATL在治疗神经系统疾病上的应用提供了潜在可能。第二部分实验,发现ATL能通过干扰LIMK/cofilin信号通路,抑制GBM的迁移侵袭及诱导GBM的凋亡发生。本部分结果表明,ATL在抗GBM迁移侵袭及诱导凋亡发生方面具有潜在的应用价值。总之,综合这两部分的实验结果,证实土木香内酯存在多途径、多靶点发挥抗胶质母细胞瘤的作用,为其临床转化应用提供有力的实验数据。
【图文】：

图 2. (A)ATL 分别作用 12h、24h 及 48h 后，MTT 法检测 ATL 对 U87、U251、U118、SHSY-5Y及 SVG p12 细胞活力的影响；(B)及作用 48h 后，计算 IC50 值。Figure 2. (A) U87, U251, U118, SH-SY5Y and SVG p12 cells were cultured with the indicatedconcentrations of ATL for the indicated hours; then, MTT assays were performed. (B) At 48 haftertreatment,the IC50 value was calculated. The data are shown as the mean ±SD of three separateexperiments (*P<0.05, **P<0.01, ATL-treated group vs. the DMSO-treated group).

Figure 2. (A) U87, U251, U118, SH-SY5Y and SVG p12 cells were cultured with the indicateconcentrations of ATL for the indicated hours; then, MTT assays were performed. (B) At 48 aftertreatment,the IC50 value was calculated. The data are shown as the mean ±SD of three separaexperiments (*P<0.05, **P<0.01, ATL-treated group vs. the DMSO-treated group).
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2690108