【摘要】：目的:胰岛细胞移植技术通过补充患者的胰岛素分泌细胞,有效地控制血糖代谢,能达到治愈糖尿病阻止各种并发症发生的目的。但该技术仍面临着供体器官稀缺、移植物存活率低等技术瓶颈。目前我国供体的唯一来源是公民自愿无偿捐献,不少器官缺血时间长,不可避免的存在缺血损伤。因此,应用药物保存胰岛细胞改善胰岛细胞活率是提高手术成功率的有效途径。我们设计实验,应用代培养技术,建立细胞因子TNF-α、IL-1β损伤模型,探讨扶芳藤含药血清对细胞因子损伤大鼠胰岛细胞谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)含量及iNOS表达的影响。方法:提取SD大鼠胰岛细胞,SD大鼠220-250g,予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉开腹后,结扎胰胆管近肝门端,自大鼠胰胆管十二指肠端注入10ml预冷的胶原酶V(0.75mg/ml),轻轻拉出肿胀的胰腺,剔除周围其他组织并获取胰腺。随后各组大鼠的胰腺于37℃水浴箱中消化15分钟并轻轻摇动。加入4℃Hank’s液终止消化并用600μm不锈钢筛网过滤,收集滤液中的细胞并在密度梯度分别为1.108、1.096、1.069和1.037的Ficoll中离心,从交界层面收集胰岛,并以4℃Hank’s液洗涤。分离后的胰岛细胞按20IEQ/孔的密度重新接种于24孔培养板中。每个培养孔的总体积为500ul。采用随机数表法将胰岛细胞随机分为3组,每组8孔(n=8),分别为空白对照组:胰岛细胞予含10%新鲜胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养;模型对照组:胰岛细胞予含10%新鲜胎牛血清的RPMI-1640培养基+细胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培养;实验观察组:胰岛细胞予含10%扶芳藤含药血清的RPMI-1640培养基+细胞因子(IL-1β50U/ml+TNF-α250U/ml)培养;各组均培养于37℃、含95%空气和5%CO_2的恒温培养箱中。丫啶橙(AO)/碘丙啶(PI)染色法双染细胞并于不同激发波长的荧光下对体外胰岛细胞进行拍照观察,计算评估胰岛细胞活率。ELISA试剂盒进行细胞谷胱甘肽(GSH)和一氧化氮(NO)水平测定。运用RT-PCR技术检测胰岛细胞iNOS mRNA的表达,Western-blot技术检测iNOS蛋白表达。结果:培养1d后各组胰岛细胞活性均有所下降,模型对照组与空白对照组相比细胞活率明显下降(P0.05);3d后,各组胰岛细胞活性均明显下降,与空白对照组相比模型对照组细胞活率大幅下降(P0.05);与模型对照组相比实验观察组细胞活率明显提高(P0.05);7d后,各组胰岛细胞活性均大幅下降,与空白对照组相比模型对照组细胞活率大幅下降(P0.05);与实验观察组相比模型对照组细胞活率明显下降(P0.05);胰岛经过24h培养后胰岛素释放实验的结果显示,空白对照组的胰岛刺激指数为2.96±0.12;模型对照组的刺激指数为2.26±0.14;实验观察组的刺激指数为2.75±0.26。模型对照组的刺激指数较空白对照组明显降低(P0.05);模型对照组的刺激指数较实验观察组显著降低(P0.05).通过对各组胰岛细胞GSH含量的检测发现,空白对照组的GSH含量为4.12±0.28umol/g prot;模型对照组的GSH含量为2.69±0.32 umol/g prot;实验观察组的GSH含量为3.43±0.43 umol/g prot;模型对照组的GSH含量较空白对照组明显降低(P0.05),模型对照组的GSH含量较实验观察组显著降低(P0.05);比较各组胰岛细胞NO含量的检测发现,空白对照组的NO含量为41.59±4.39 umol/L;模型对照组的NO含量为56.91±10.09 umol/L;实验观察组的NO含量为43.65±2.57 umol/L。模型对照组NO含量较空白对照组明显升高(P0.05);模型对照组的NO含量较实验观察组显著升高(P0.05);利用RT-PCR方法检测各组胰岛细胞iNOS mRNA表达水平,结果显示模型对照组的iNOS mRNA表达水平较空白对照组明显升高,(P0.05);模型对照组的iNOS mRNA表达水平较实验观察组显著升高,(P0.05);利用Western-blot检测各组胰岛细胞iNOS蛋白的表达水平,实验发现:模型对照组的iNOS蛋白的表达水平较空白对照组明显升高(P0.05);模型对照组的iNOS蛋白的表达水平较实验观察组显著升高(P0.05)。结论:细胞因子TNF-α及IL-1β能诱导胰岛细胞iNOS的过表达,生成大量NO对胰岛细胞胰岛素分泌功能造成损伤,降低细胞存活率,加重细胞的氧化应激损伤,减少胰岛细胞GSH含量。扶芳藤可能通过阻断细胞iNOS的过表达,抑制NO大量生成,提高GSH含量,减轻细胞因子对胰岛的损害。
【图文】：
在灌及胰为 0腺体灌注前破心胰岛的分离0.75mg／体组织呈分心放血处死离的过程。ml)10ml分叶状，边死大鼠，，。之后连接逆行注入边灌注边10注意勿使接注射器入胰胆管内边将大鼠脾使血液流入将预冷的内。灌注过脾脏提起使入胰腺周围的 4℃胶原过程可见胰使胰腺灌注围影响胰腺原酶 V 溶液胰腺逐渐膨注充分，避腺消化液(浓度膨胀，避免胰
胰胆管穿刺遣入灌注钊头
【学位授予单位】：广西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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2690116
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