【摘要】：目的:如圣汤出自由明太祖第五子周定王主持,教授滕硕、长史刘醇等人执笔汇编而成的《普济方》,该书是中国历史上最大的方剂书籍。处方由四味药物:桔梗、甘草、牛蒡子和麦门冬组成,书中记载其功效主要为治痰去热,利咽喉,治咽中有疮咽物不下等。通过查阅现代研究文献发现,这四味单味药在治疗咽喉肿痛和抑菌方面均有一定作用,主要作用为抗菌消炎方面。目前,科研文献中有关如圣汤单味药研究的报道较多,但关于如圣汤的研究较少,对如圣汤现代制剂研究未见报道。因此,本课题通过文献检索明确四味中药抗菌消炎的活性组分:桔梗总皂苷、甘草总三萜皂苷、牛蒡子总木脂素、麦门冬总皂苷和多糖,分别对其进行提取、纯化,并比较研究纯化前后体外药效,采用正交优化确定各有效组分的最佳提取工艺,并采用大孔吸附树脂法确定各有效组分的最佳纯化工艺,采用牛津杯法和二倍稀释法分别对各组分纯化前后进行体外抑菌作用效果进行比较研究。将纯化前后的有效成分按照《普济方》原方中配伍比例进行配伍,比较配伍组和如圣汤的体外抑菌作用。将配伍组制成如圣口服液,采用HPLC方法测定如圣口服液中桔梗皂苷D的含量。同时,对如圣口服液进行初步的药效学研究。为如圣汤的合理利用和开发提供依据。材料与方法:1.采用正交试验设计法分别对桔梗总皂苷、甘草总三萜皂苷、牛蒡子总木脂素、麦门冬总皂苷和多糖进行提取工艺考察,确定各组分的最佳提取工艺;采用大孔吸附树脂法,通过静态、动态吸附与解吸实验,优选处方中桔梗、甘草、牛蒡子、麦门冬有效组分的最佳纯化工艺。2.使用牛津杯法和二倍稀释法,选择的指标是抑菌圈直径和MIC值,研究桔梗总皂苷、甘草总三萜皂苷、牛蒡子总木脂素、麦门冬总皂苷和多糖纯化前后对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌体外抑菌作用的差异。3.采用牛津杯法和二倍稀释法,将抑菌圈直径和MIC值作为指标,对如圣汤总提液和配伍纯化前后的有效组分进行抑菌作用的研究。4.采用HPLC方法,对自制的如圣口服液中桔梗皂苷D的含量进行测定,建立如圣口服液的初步标准。5.如圣口服液初步药效学研究,通过小鼠氨水引咳和小鼠酚红排泄实验来证明如圣口服液的镇咳和祛痰作用。结果:1.桔梗总皂苷的制备:最佳提取工艺是提取3次,每次用6倍量60%乙醇提取1.5小时。最佳纯化工艺是用D101型大孔吸附树脂进行纯化,以饮片量与树脂体积比换算上样量计算结果为0.75g·mL~(-1),上样浓度为0.20g·mL~(-1),除杂用水量为50mL,以80%乙醇为洗脱剂,洗脱用量60mL,洗脱液蒸干,即得含量为7.40mg·g~(-1)、出膏率为1.99%的桔梗总皂苷纯化物。2.甘草总三萜皂苷的制备:最佳提取工艺是提取2次,每次用8倍量60%乙醇提取1.5小时。最佳纯化工艺是用HPD-300型大孔吸附树脂进行纯化,以饮片量与树脂体积比换算上样量计算结果为0.25g·mL~(-1),上样浓度为0.10g·mL~(-1),除杂用水量为72mL,以70%乙醇为洗脱剂,洗脱用量70mL,洗脱液蒸干,即得含量为252.33mg·g~(-1)、出膏率为11.85%的甘草总三萜皂苷纯化物。3.牛蒡子总木脂素的制备:最佳提取工艺是将牛蒡子较浅破碎(压碎,不过筛),提取3次,每次用12倍量80%乙醇提取1.5小时。最佳纯化工艺是用AB-8型大孔吸附树脂进行纯化,以饮片量与树脂体积比换算上样量计算结果为0.35 g·mL~(-1),上样浓度为0.050g·mL~(-1),除杂用水量为60mL,以70%乙醇为洗脱剂,洗脱用量50mL,洗脱液蒸干,即得含量为205.09mg·g~(-1)、出膏率为7.88%的牛蒡子总木脂素纯化物。4.麦冬多糖的制备:最佳提取工艺是提取2次,每次用8倍量水提取0.5小时,以浓度80%乙醇进行醇沉,收集沉淀物蒸干,即得含量为28.80mg·g~(-1)、出膏率为28.94%的麦冬多糖纯化物。5.麦冬总皂苷的制备:最佳的提取工艺是提取3次,每次用8倍量70%乙醇提取1小时。最佳纯化工艺是用D101型大孔吸附树脂进行纯化,以饮片量与树脂体积比换算上样量计算结果为1.50g·mL~(-1),上样浓度为0.10g·mL~(-1),除杂用水量为72mL,以70%乙醇为洗脱剂,洗脱用量60mL,洗脱液蒸干,即得含量为0.50mg·g~(-1)、出膏率为2.03%的麦冬总皂苷纯化物。6.桔梗总皂苷纯化前后体外抑菌作用比较:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为9.33±0.58mm、14.17±1.61mm、MIC值分别为125.00mg·mL~(-1)、62.50mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径为9.67±0.58mm、10.27±0.58mm、MIC值分别31.25mg·mL~(-1)、31.25mg·mL~(-1);甘草总三萜皂苷纯化前后体外抑菌作用比较:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为10.27±0.58mm、24.06±0.99mm、MIC值分别为250.00mg·mL~(-1)、125.00mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径为7.68±0.15mm、8.75±0.46mm、MIC值分别31.25mg·mL~(-1)、15.63mg·mL~(-1);牛蒡子总木脂素纯化前后体外抑菌作用比较:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为9.33±0.58mm、10.00±0.50mm、MIC值分别为250.00mg·mL~(-1)、125.00mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径为8.00±1.00mm、9.50±0.50、MIC值分别250.00mg·mL~(-1)、250.00mg·mL~(-1);麦冬多糖纯化前后体外抑菌作用比较:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为6.66±0.29mm、6.83±0.29mm、MIC值分别为250.00mg·mL~(-1)、250.00mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径基本没有,MIC值分别500.00mg·mL~(-1)、500.00mg·mL~(-1);麦冬总皂苷纯化前后体外抑菌作用比较:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为7.30±0.47mm、8.35±0.15mm、MIC值分别为250.00mg·mL~(-1)、125.00mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径为7.26±0.35mm、7.55±0.10mm,MIC值分别250.00mg·mL~(-1)、125.00mg·mL~(-1)。7.如圣汤汤剂体外抑菌作用结果:作用于金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的抑菌圈直径为14.00±1.73mm、9.33±1.53mm、MIC值分别为250.00mg·mL~(-1)、125.00mg·mL~(-1);配伍组纯化前后体外抑菌作用结果:作用于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.33±1.53mm、17.67±2.52mm、MIC值分别为125.00mg·mL~(-1)、62.50mg·mL~(-1)、作用于肺炎链球菌的抑菌圈直径为8.33±0.58mm、13.67±0.58mm、MIC值分别15.63mg·mL~(-1)、7.80mg·mL~(-1);结果显示,配伍组分在纯化前后的抑菌作用效果强于如圣汤,并且纯化后配伍组的抑菌作用优于纯化前的配伍组。8.如圣口服液中桔梗皂苷D含量测定结果显示,桔梗皂苷D进样量在0.15~14.45μg范围内线性关系较好,r=0.9995,测定桔梗皂苷D含量为18.69mg/mL。方法学考察精密度、重复性、稳定性均良好,加样回收率为RSD=1.78%。9.通过小鼠体内药效学研究表明,如圣口服液高剂量组能够延长氨水引咳小鼠咳嗽的潜伏期和减少一定时间内咳嗽的次数。如圣口服液高剂量组的小鼠酚红排泄量大于阳性对照组。表明在如圣口服液的作用下,小鼠呼吸道黏膜排出的酚红量增多,如圣口服液能够影响气道的通透性和分泌液量。小鼠药效学实验表明,如圣口服液具有镇咳、祛痰的作用。结论:1.通过正交提取实验和动静态考察大孔吸附法对如圣汤中有效组分进行提取和纯化,确定工艺参数且工艺方法先进合理,适合工业生产等优点,为桔梗、甘草、牛蒡子和麦冬四味药物的进一步研究及开发奠定理论基础。2.通过有效组分纯化前后抑菌圈直径和MIC值说明,在对单味药有效成分进行纯化的过程中,降低了出膏率,通过纯化前后抑菌作用比较试验,说明,在纯化操作过程中,抑菌活性成分没有明显损失,表明纯化工艺合理,减少复方服用量。3.通过配伍组和如圣汤抑菌效果比较,配伍组分在抑菌圈直径和MIC上的抑菌效果都强于如圣汤。表明,配伍组不仅减少服用量,而且在疗效上更具有优势。4.测定如圣口服液中桔梗皂苷D的含量,为如圣口服液建立了初步的质量标准。5.通过体内初步药效学实验表明,如圣口服液具有镇咳和祛痰的作用,为如圣口服液在药理方面上提供了依据。
【图文】：
图 1-1 标准曲线回归方程为 y=6.8493x-0.0080 r=0.9998（n=6）。表明桔梗皂苷在 0.0255mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系。2. 提取工艺研究2.1 正交实验结果表 1-3 正交试验直观分析结果因素A 醇浓度（%）B 溶剂用量（倍）C 提取时间（h）D 提取次数（次）出膏率（%）总皂苷提取量（mg·g-1）权重分实验 1 1 1 1 1 31.11 26.62 0.84实验 2 1 2 2 2 24.44 24.93 0.74实验 3 1 3 3 3 23.33 13.94 0.52实验 4 2 1 2 3 37.78 19.44 0.78
HPD100 23.85 19.19 71.57HPD300 29.91 56.27 47.10HPD600 22.89 36.28 67.16计算公式如下：=（吸附前药液质量浓度 吸附后药液质量浓度） 药液体积吸附量树脂干重% = 100% （吸附前药液质量浓度 吸附后药液质量浓度）率（ ）吸附前药液质量浓度% = 100% （解吸后药液质量浓度 解吸后药液体积率（ ）吸附总量通过实验结果，D101 型树脂对桔梗总皂苷的吸附率和解吸率均较高。因此， D101 树脂纯化桔梗总皂苷。泄露曲线的绘制
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6;R286.0
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本文编号：
2690140
