高速逆流色谱分离纯化百华花楸中的多酚化合物及几种小分子化合物与人血清白蛋白相互作用研究

发布时间：2020-06-01 02:05

【摘要】：1.高速逆流色谱分离纯化百华花楸中的多酚化合物百华花楸(Sorbus pohuashanensis Hedl.)为蔷薇科花楸属植物,其果为花楸果。民间常以果实入药,具有镇咳、平喘、抗炎、抗氧化、抗辐射和抗癌等药理活性,且花楸果中含有丰富的黄酮和酚类成分是其主要的活性成分。高速逆流色谱(HSCCC)是新型的液-液分配色谱,不以固体材料为载体,消除了固定相对样品的不可逆吸附以及样品分离过程中的污染、变性等问题,具有成本低、操作简单、分离度高等优点。本文首次采用高速色谱对百华花楸果中的多酚化合物进行分离。本研究采用超声提取,通过聚酰色谱柱梯度洗脱,得到50%和70%洗脱组分,利用优化后的液相条件对花楸果中的成分进行分析,对两相体系进行筛选。通过分配系数(K)、分配因子(α)及固定相保留率(S_F)确定最优的两相体系为乙酸乙酯-正丁醇-水3.5:1.5:5(50%组分)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水1:3:1:3.5(70%组分)。然后对高速逆流色谱进行参数考察,结果显示50%组分和70%组分在进样量150 mg、转速850 r/min、流速2.0 mL/min时分离效果最好。本实验仅通过一步高速逆流色谱分离纯化,成功得到了5种多酚化合物,分别为:新绿原酸(30.2 mg)、绿原酸(28.5 mg)、槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4'''-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷(7.5 mg)、3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸(6.3 mg)和芦丁(9.4mg),且样品纯度都在95%以上。这五种成分中除芦丁外其余四种化合物是首次从百华花楸中分离得到的,其中绿原酸和新绿原酸是同分异构体,而槲皮素-3-O-(6″-α-L-鼠李糖基-4'''-α-L-鼠李糖基)-β-D-葡萄糖苷和3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸是首次从花楸属果实中分离鉴定的。本实验建立了一种快速分离百华花楸果中多酚化合物的有效方法,为花楸果中有效成分的深入研究和工业生产奠定基础,同时促进其在食品、化妆品、药品等领域的开发应用。2.几种小分子化合物与人血清白蛋白相互作用研究款冬酮(Tussilagone)为款冬花的活性倍半萜,具有镇咳平喘、抗炎、降脂、抗过敏等药理活性。基于本课题组对款冬酮药代动力学和体内、体外代谢研究,为了使款冬酮的体内过程研究更加全面科学,本文首次开展款冬酮与人血清白蛋白(HSA)相互作用研究。作为具有相似药理活性的金丝桃苷是一种重要的黄酮醇苷类化合物,具有镇咳祛痰、抗炎、抗氧化、抗过敏、镇痛、保肝、抗肿瘤等功效。本文研究了金丝桃苷与HSA的相互作用,并探讨了维生素C(VC)存在下对金丝桃苷与HSA相互作用的影响。该研究通过对其猝灭类型、结合距离(r)、结合位点、结合位点数(n)、结合常数(Ka)及蛋白质的构象变化等方面进行探究,有助于了解款冬酮、金丝桃苷在体内的生物利用度及分布、代谢、排泄等过程,为款冬酮、金丝桃苷的药代动力学和临床用药提供指导。更为探索复杂体系内药物-蛋白质相互作用规律提供参考。本研究应用紫外-可见光谱、荧光光谱、圆二色光谱及分子对接等技术,通过Stern-Volmer方程、双对数方程、F?rster非辐射能量转移理论和Van’t Hoff方程研究款冬酮-HSA、金丝桃苷-HSA、金丝桃苷-VC-HSA的相互作用。结果显示,款冬酮、金丝桃苷对HSA猝灭类型为静态猝灭。款冬酮通过疏水作用力和氢键而金丝桃苷通过疏水作用力与HSA形成1:1的复合物,且都作用于HSA的Site I。而VC存在下,使金丝桃苷与HSA的作用力类型变为范德华力或氢键。此外VC存在时也会使金丝桃苷与HSA的结合常数降低,即VC与金丝桃苷共存时,VC会降低金丝桃苷与HSA结合的稳定性。款冬酮与HSA的结合距离为2.07 nm,金丝桃苷与HSA的结合距离为2.49 nm,说明款冬酮-HSA、金丝桃苷-HSA之间存在非辐射能力转移。但当VC存在时会使金丝桃苷-HSA的结合距离增大到2.75nm。采用三维荧光光谱、CD光谱检测结果显示,款冬酮、金丝桃苷诱导HSA的构象发生了改变。VC的存在也会进一步使金丝桃苷-HSA体系中HSA的构象发生改变。利用分子对接模拟技术,则从分子水平上获得了款冬酮-HSA、金丝桃苷-HSA、金丝桃苷-VC-HSA结合的氨基酸残基及与HSA的作用位点,并对上述研究提供了佐证。
【图文】：

高速逆流色谱,结构示意图

单、应用范围广、分离量大、回收率高等优点，，特别适用于极性物的分离及纯化[62,63]。其具体原理应用等将在下一节中详细介绍。速逆流色谱技术天然产物分离分析技术的发展，其丰富的研究成果被广泛的应用、食品、化工等领域。现代产业的高速发展和人们对高质量生活然产物的分离朝着高效率、快速、高通量的方向发展。速逆流色谱的构造逆流色谱是目前国际上比较先进的现代色谱分离纯化技术，是由研发的一种新型液-液分配色谱技术。如图 0-1 所示，HSCCC 一般、控温系统、输液泵、进样阀、主机、控制器、检测器、组分接组成。

示意图,高速逆流色谱,主机构,示意图

前言主机的构造示意图如图 0-2 所示[64]，是由两个大小完全相同中心齿轮形状组成，中心齿轮安装在公转轴上，行星齿轮装在自转轴上。公轴水平放置。HSCCC 色谱柱上的多层螺旋管，缠绕在位于自转轴的鼓仪器中，为保证平衡，主机中一般在螺旋管的对称位置安装一个配个到两个相同的螺旋管。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1;R285

【参考文献】