【摘要】：目的:观察独活香豆素对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞活性和炎症因子IL-1β、TNF-α的影响,探讨独活香豆素对神经元样PC12细胞保护作用的机制,为独活香豆素治疗帕金森病提供实验依据及理论基础。材料与方法:1.含药血清制备:应用随机法,将大鼠分四组为:正常组(20只)、吐温80组(10只)、塞来昔布组(10只)、独活香豆素组(10只)。正常组大鼠予生理盐水灌胃,吐温80组予0.08%吐温80,2ml/次,塞来昔布和独活香豆素组大鼠给药剂量按照人与大鼠给药剂量换算公式进行计算,塞来昔布组按照说明书中成人每天常规用量进行折算,独活香豆素组大鼠实际给药量按照成人每天10g独活饮片的3倍~([8])量进行折算。给药时间为上午8∶00~10∶00,每日1次,2ml/次/只,连续给药7天。最后一次给药2h后腹主动脉取血,静置2h,2000r/min离心10min后分离血清。经56℃,30min灭活,0.22μm滤膜过滤灭菌,放置-20℃冰箱保存备用。2.PC12细胞分化与培养:大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12)经神经生长因子(NGF)诱导后转化为神经元样PC12细胞,然后选择含15%马血清的细胞培养基培养,取对数生长期,按照1×10~5/ml密度,接种于96孔板中培养,100μl体系,待培养24小时细胞贴壁生长后,进行Lactacystin与含药血清浓度的筛选。3.Lactacystin作用浓度的确定:将Lactacystin配制成1mmol/l的母液,然后将Lactacystin母液稀释为0μmol/l、5μmol/l、10μmol/l和20μmol/l终浓度加入到细胞培养基中,作用时间为24h,通过MTT检测各组细胞相对存活率,最后确定Lactacystin诱导神经元样PC12细胞作为帕金森病细胞模型的最佳作用浓度为5μmol/l。4.含药血清作用浓度及时间的确定:取对数生长期的神经元样PC12细胞,按照1×10~5/ml密度,接种于96孔板中培养,100μl体系,待培养24小时细胞贴壁生长后,将细胞共分成16组,分别为空白对照组(马血清)、正常对照血清组、模型血清组、吐温血清组、塞来昔布血清组、独活香豆素血清组,再将除空白对照组以外的含药血清组分为10%、15%、20%三个浓度组,更换相应浓度的培养基,保护时间分别为24h、48h后,除空白对照组和正常血清对照组外,其余各组分别加入5μmol/l Lactacystin作用24h。最后应用MTT检测细胞相对存活率,确定最佳含药血清浓度为15%,最佳的作用时间为24h。5.分组与给药:实验分为五组,分别为正常对照组、模型组、吐温组、塞来昔布组、独活香豆素组。按照以1×10~5/ml的密度将对数生长期的PC12细胞一部分接种于两个96孔板中培养,同时一部分接种于6孔板中培养,分别选取浓度为15%不同的含药血清培养24h后,除了正常对照组外其余各组分别加入5μmol/l Lactacystin,24h后收集细胞及细胞上清液。6.指标检测及统计学处理:应用MTT检测各组细胞活性。应用ELISA法检测IL-1β、TNF-α的蛋白含量。应用RT-PCR法检测IL-1β、TNF-α的mRNA表达。采用SPSS19.0统计软件对实验结果进行分析统计,所有实验数据均采用x±S表示多组间实验数据采用单因素方差分析,以p0.05为有统计学差异。结果:1.Lactacystin作用浓度的确定结果发现应用MTT法测定的吸光度值均随着Lactacystin浓度增加而逐渐降低,即Lactacystin有明显剂量依赖性地抑制细胞活性的作用。当Lactacystin作用浓度为5μmol/l时,细胞相对存活率最高。因此选择浓度为5μmol/l,作用24h为诱导神经元样PC12细胞的刺激条件。2.含药血清作用时间和浓度的确定经筛选确定5μmol/lLactacystin作用24h作为刺激条件。用不同浓度的含药血清对细胞进行干预保护,与不同浓度的模型组相比,实验结果显示15%含药血清保护24h、48h,细胞OD值及相对存活率显著性增高(p0.01),而15%浓度含药血清保护24h细胞OD值及相对存活率高于48h。本着相对存活率最高的最低血清浓度的原则,最终选用15%浓度含药血清保护24h作为最佳条件。3.各组血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞活性的影响通过MTT检测模型组细胞活性情况,结果发现:模型组与吐温80组之间细胞OD值无统计学差异(p0.05);模型组和吐温组细胞OD值显著低于正常对照组(p0.01)。独活香豆素组细胞OD值高于模型组(p0.01)、吐温80组(p0.01)和塞来昔布组(p0.01),但低于正常对照组(p0.01);塞来昔布组细胞OD值高于模型组(p0.01)和吐温80组(p0.01),但低于正常对照组(p0.01)和独活香豆素组(p0.01)。4.各组血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响4.1Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响结果显示:模型组与吐温80组之间无统计学差异(p0.05);与正常对照组相比,模型组细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表达均显著升高(p0.01)。4.2塞来昔布对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响结果显示:塞来昔布组细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表达均低于模型组(p0.01),而细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表达均高于独活香豆素组(p0.01)。4.3独活香豆素对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响结果显示:独活香豆素组与模型组相比,细胞上清液中IL-1β、TNF-α蛋白的含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表达均显著下降(p0.01),与塞来昔布组相比IL-1β、TNF-α蛋白的含量和细胞中IL-1β、TNF-αmRNA的表达均低于塞来昔布组(p0.01)。结论:1.本实验应用Lactacystin蛋白酶体抑制剂,成功模拟出帕金森病神经元细胞损伤模型。模型组神经元样PC12细胞活性下降,炎症因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表达均升高。2.独活香豆素含药血清能促进Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞增殖;且独活香豆素含药血清能够下调Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞炎症因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表达。3.独活香豆素含药血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞具有保护作用,与其下调细胞炎症因子IL-1β、TNF-α蛋白的含量和IL-1β、TNF-αmRNA的表达,抑制Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞的炎症反应密切相关。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
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2690863
