大黄素调节中性粒细胞防治肺癌的机制研究

发布时间：2020-06-01 07:14

【摘要】：肺癌的发病率和死亡率居于恶性肿瘤的首位,化疗在肺癌防治过程中一直处于主导地位,积极开发有效的肺癌防治药物尤为重要。炎性反应是肿瘤的十大特征之一,其中中性粒细胞是肿瘤微环境中最主要的炎性细胞,在肿瘤发生、发展及预后中的作用已经受到了广泛重视。中性粒细胞在不同的肿瘤微环境中可以极化为促癌和抑癌两种表型。最近研究表明:高凝状态所造成的肺栓塞大大缩短了肺癌患者的生存期,成为肺癌患者的第二大死因,而肿瘤相关中性粒细胞(TANs)活化后形成的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是造成肺癌相关高凝状态以及血栓形成的主要原因。然而,中性粒细胞和高凝状态与肺癌发生之间的关系尚不明确。大黄素是大黄的有效成分之一,具有抗炎和抗肿瘤等多种药理活性,其防治肿瘤作用是否与影响中性粒细胞表型相关未有报道。本研究目的是探究中性粒细胞和高凝状态与肺癌发生的关系,以及大黄素是否能影响中性粒细胞表型防治高凝和肺癌及其作用机制。本研究分体内,体外和机制研究三个部分。在体外研究中,用ATRA诱导HL-60分化为HL-60N1,继续用TGF-β诱导HL-60N1分化为HL-60N2,获取两种表型的中性粒细胞,以不同浓度的大黄素处理HL-60N1和HL-60N2,MTT法检测大黄素对细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI染色检测大黄素对细胞凋亡的影响;激光全息检测大黄素对细胞形态、细胞体积的影响;中性红摄取检测大黄素对细胞摄取能力的影响。在体内研究中,建立乌拉坦致肺癌模型,检测肺癌发生发展过程中凝血状态及肺泡中性粒细胞的数目、CD66b的表达和NETs形成的变化;采用HE染色检测小鼠肺组织病理变化,评价大黄素对肺癌的防治效果,并检测大黄素在肺癌的防治过程中凝血状态及中性粒细胞数量和表型变化;采用Ly6G mAb耗竭中性粒细胞,分析中性粒细胞在肺癌发生过程中的作用,以及和大黄素合用的效果。建立LLC异位移植瘤模型,检测过继性输注HL-60N1和HL-60N2细胞对肿瘤生长的作用,免疫印记法检测瘤组织内中性粒细胞MPO、CD66b的表达,探究大黄素在治疗肿瘤过程中对中性粒细胞的调节作用和高凝防治作用。为了进一步探索大黄素调节中性粒细胞防治高凝状态和肺癌的机制,在体外实验中,检测大黄素对HL-60N1和HL-60N2细胞CD66b表达、NETs形成、吞噬作用、自噬能力和ROS产生的影响,评价大黄素对中性粒细胞表型和功能的影响。在乌拉坦肺癌模型中,免疫组化检测大黄素对乌拉坦诱导肺癌小鼠肺组织中性粒细胞表型标志物(Ly6G和CD66b)和NETs形成标志物(PAD4和CitH3)表达的影响;ELISA检测肺泡细胞因子IFN-γ,IL-12、ROS、IL-6,TNF-α和TGF-β1的表达。最后,采用网络药理学预测并解释大黄素调节肿瘤相关中性粒细胞防治高凝和肺癌的分子机制。体外结果显示,HL-60经ATRA诱导后分叶核明显,经TGF-β诱导后细胞体积增大,CD66b表达增多;大黄素在20μM时,对HL-60N1细胞活性几乎无影响,但可以促进HL-60N1细胞对中性红的摄取;对HL-60N2细胞,大黄素抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,并伴随着细胞体积的减小。体内结果显示,在乌拉坦肺癌模型中,肺组织癌变前,小鼠已经出现了高凝状态和N2型中性粒细胞增多;在肺癌发生后,N2型中性粒细胞数目持续增多,凝血持续加重;大黄素治疗后,肺组织结节数目,癌变面积明显减小,高凝状态得到改善,肺泡N2型中性粒细胞聚集和NETs形成明显减少。Ly6G mAb耗竭中性粒细胞可以改善高凝状态并防治肺癌,但减弱大黄素对肺癌的防治作用。在LLC异位移植瘤模型中,大黄素阻止过继性输注HL-60N2细胞的促凝和促肿瘤作用,与过继性输注HL-60N1协同抑制肿瘤生长,免疫印记结果显示,大黄素促进瘤组织中性粒细胞MPO的表达,抑制CD66b的表达。机制研究表明,大黄素在体外促进HL-60N1细胞的吞噬作用、增加活性氧的产生;对于HL-60N2细胞,大黄素降低CD66b的表达和NETs的形成,抑制自噬能力。在乌拉坦肺癌模型中,大黄素可以抑制肺组织中性粒细胞CD66b、PAD4和Cit-H3的表达;ELISA检测结果显示大黄素升高肺泡中IFN-γ、IL-12和ROS水平,降低IL-6、TNF-α和TGF-β1水平。网络药理学分析表明,大黄素通过调节Jak-Stat,Toll样受体等信号通路,抑制TANs自噬,使NETosis这一生物过程转化为凋亡,从而逆转TANs的促凝和促癌效应。综上所述,中性粒细胞增多症和高凝状态与乌拉坦肺癌进展呈正相关;CD66b~+中性粒细胞(N2)在肺组织的聚集和NETs所造成的高凝状态共同导致了肺癌的发生;大黄素选择性抑制N2中性粒细胞的激活,并保留N1中性粒细胞防治高凝和肺癌。
【图文】：

吉姆萨染色,分页

每孔继续加入 0.1 mL 的 0.072%中性红溶液，30 min 后用 96 孔板离心机离心，弃上清，PBS 洗 3 次，每次 3 min，接着每孔加入细胞溶解液（乙酸：无水乙醇=1：1）100uL，静置 6-8h，酶标仪测在 540 nm 处的 OD 值，实验重复 3 次。2.3.6 数据分析使用 GraphPad Prism 7.0 版软件对实验数据进行作图和统计学分析。两组间的差异用 t 检验来进行评价。*P <0.05 有统计学差异，，**P <0.01 为极显著差异。2.4 实验结果2.4.1 HL-60 分化为 HL-60N1 和 HL-60N2 的检测HL-60 细胞核较大，无分页核，经过 ATRA 诱导 7 天后，出现分页核（如图 2-1），CD66b 的表达变化无明显变化（如图 2-2）；又经过 TGF-β诱导后细胞核分页更明显、体积增大（如图 2-1），CD66b 的表达明显增加（如图 2-2）。

细胞,大黄素

图 2-2 细胞 CD66b 的表达Fig.2-2 The CD66b expression of cells2.4.2 大黄素对 HL-60N1 和 HL-60N2 细胞增殖能力的影响大黄素在低浓度时对 HL-60N1 的增殖能力影响较小，在 20 μM 以下对 HL-60N1的增殖能力几乎无影响，在 40 μM 时出现抑制作用。大黄素在 20 μM 可以明显抑制HL-60N2 的增殖，并呈剂量依赖性（如图 2-3）。（*P < 0.05， **P < 0.01 vs HL-60N1）。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

【参考文献】